PCRSSCP法检测人类补体第八成分C8A DNA多态性研究.pdf

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1、P C R - S S C P法检测人类补体第八成分 C 8 AD N A多态性研究* 杨志惠1,张林1 , 2 ,周斌1,王闯1,贾静1 1 .四川大学华西基础医学与法医学院 法医物证学教研室(成都6 1 0 0 4 1 ) ; 2 .四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室 【摘要】 目的建立一种检测人类补体C 8 AD NA多态性的新方法。方法 C 8 A多态性的分子基础是C 8 A基 因在第三外显子碱基发生了C A的突变,通过特异性扩增C 8 A基因第三外显子,采用聚合酶链反应-单链构象多 态性( P C R - S S C P )方法结合D NA序列分析检测成都地区9 8份无血缘关系

2、样本D NAC 8 A基因型。结果共发现3 种基因型, C 8 A*AA、 C 8 A*B B和C 8 A*AB ,观测到的基因型频率分布符合Ha r d y - We i n b e r g平衡定律。结论 P C R - S S C P检测C 8 A多态性快速、 简便、可靠、成本低,适用于大样本的筛选,在群体遗传学及法医学实践中有较好 的应用价值。 【关键词】 P C R - S S C P 人类补体C 8 A多态性 【中图分类号】 R 3 9 4 - 3 3 D e t e c t i n gt h eD N AP o l y mo r p h i s mo f Hu ma nC o mp

3、 l e me n t C o mp o n e n t C 8 Ab yP C R - S S C PA n a l y s i s Y A N GZ h i - h u i , Z H A N G L i n ,Z H t u v i n ,wA N G x h u y n z , | A i n z e p a r t me n to fF o r e n s i cB i o l o g y , We s tC h i n aS c h o o lo f P r e c l i n i c a l a n dF o r e n s i cMe d i c i n e ,S i c h

4、u a nUn i v e r s i t y ,C h e n g d u6 1 0 0 4 1 ,C h i n a 【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v eT h ea i m o ft h i ss t u d yi st oe s t a b l i s h an e w me t h o df o rd e t e c t i n gt h eD NA p o l y mo r p h i s m o f h u ma nc o mp l e me n t c o mp o n e n t C 8 AMe t h o d s B a s e do n

5、t h ep o i n t mu t a t i o n ( C A)o f C 8 Ag e n e i ne x o n 3 , T h eg e n o t y p e so f 9 8u n r e l a t e di n d i v i d u a l sf r o m Ha np o p u l a t i o ni nC h e n g d uwe r es t u d i e db yp o l y me r a s e c h a i nr e a c t i o n - s i n g l es t r a n dc o n f o r ma t i o np o l

6、y mo r p h i s m( P C R - S S C P ) a n a l y s i s f o l l o we db yD NAs e q u e n c i n g R e s u l t s T h eg e n o t y p e so fC 8 A* AA,C 8 A* B B a n dC 8 A* AB we r eo b s e r v e da n dt h ed i s t r i b u t i o no ft h eg e n o t y p e s f r e q u e n c i e so f C 8 Ai nC h e n g d uHa np

7、o p u l a t i o nwa si na c c o r d a n c ewi t hHa r d y - We i n b e r ge q u i l i b r i u m C o n c l u s i o n T h eme t h o do f P C R - S S C Pi s r e l i a b l e ,r a p i d ,s i mp l e a n dc o s t - e f f e c t i v e i nd e t e c t i n gt h e D NAp o l y mo r p h i s mo f C 8 A, a n di t i

8、sv a l u a b l ef o rf u r t h e ra p p l i c a t i o ni np o p u l a t i o ng e n e t i cs t u d ya n df o r e n s i cs c i e n c ep r a c t i c e 【 Ke yw o r d s 】P C R - S S C PHu ma nc o mp l e me n t c o mp o n e n t C 8 AP o l y mo r p h i s m 人类补体第八成分( C 8 )由 、 、 三个亚基组 成, 、 、 三个亚基分别由不同的等位基因控制

9、,即 C 8 A、 C 8 B 、 C 8 G基因。C 8 A等位基因C 8 A*A及 C 8 A*B差异的分子基础是C 8 A*B第三外显子上 第1 8 7位碱基发生了C A的突变。张林等 1 针对 这一突变,建立了等位基因特异性扩增技术检测 C 8 AD NA多态性的方法。本研究首次采用一种简 单的D NA分型方法,即聚合酶链反应-单链构象多 态性( P C R - S S C P )分型方法,并以核苷酸序列分析 方法为验证方法,检测成都地区汉族群体C 8 A基因 型频率的分布,报告如下。 1 材料与方法 1 1 D N A样本 *高校博士点基金( 2 0 0 4 0 6 1 0 0 4

10、7 )及四川省杰出青年带头人培 养基金( 0 4 Z Q0 2 6 - 0 2 7 )资助 C o r r e s p o n d i n ga u t h o r , E - ma i l : k j c s c u e d u c n 9 8份血样采自中国成都地区无血缘关系、健康 汉族成人个体静脉血,经 E D T A抗凝, -2 0保 存,酚/氯仿方法提取D NA 2 。 1 2 引物 根据文献设计一对特异性扩增 C 8 A基因第3 外显子引物 1 ,由成都榕海生物有限公司合成。其序 列为C 8 A3 d : 5 - G G TT G AT T GAT TG ATT G G T T GA

11、- 3 ; C 8 A 3 u : 5 - T C AC T TT T GAC AG G C AC AG C - 3 。 1 3 聚合酶链反应 P C R总体系为3 7 5 L , 双蒸水2 1 7 L , T a q 酶0 3 L ( 5 U/ L ) ,引物C 8 A3 d及C 8 A3 u共1 5 L ( 各1 0p mo l / L ) ,Mg 2 + 2 2 5 L ( 2 5mmo l / ml ) , 1 0 P C R缓冲液3 7 5 L ,d NT P6 L ( 1 5 0mmo l / mL ) , 模板D NA2 L (约5n g ) 。在B i o - R a d热循环

12、 仪上进行扩增,热循环条件: 9 4预变性2mi n , 9 4 变性3 5s , 6 3退火4 5s , 7 2延伸5 5s , 2 8个循 环,7 2末次延伸7mi n 。 四 川 大 学 学 报(医 学 版) JS i c h u a nU n i v( Me dS c i E d i ) = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 2 0 0 6 ;3 7 ( 3 )

13、: 4 7 14 7 3 1 . 4 S S C P分析 取2 LP C R产 物 与 8 L变性上样缓冲液 ( 9 5 %甲 酰 胺, 0 . 0 3 %二 甲 苯 青, 0 . 0 5 %溴 酚 蓝, E D T A 2 0mmo l / L )混匀,沸水浴1 0mi n ,立即冰 浴,取4 L混合物上样。电泳条件:非变性聚丙烯酰 胺凝胶( T=8 %, C =3 . 3 3 %) ,4恒温, 0 . 5 T B E 电泳缓冲液,恒压2 0 0V,电泳1 7h 。银染显色。 1 . 5 C 8 A基因型判型标准 根据P C R - S S C P得出的不同谱带进行分型,谱 带一致的为一型,

14、从每一型中选取一例P C R扩增产 物纯化后,由上海博亚生物有限公司采用AB I 3 7 3 0 自动测序仪测序, C 8 A基因第三外显子有纯合性 C A碱基突变者基因型为C 8 A*B B , 无突变者纯 合子基因型为C 8 A*AA,杂合性突变者其基因型 为C 8 A*AB ,有其它突变为稀有亚型。 1 . 6 统计学方法 采用x 2检验进行 Ha r d y - We i n b e r g平衡检测。 2 结果 采用P C R - S S C P对C 8 A基因型分布进行研究, 结果显示,样本1 、 2 、 5 、 8均表现为4条带,但带谱不 一样,样本3 、 4 、 6 、 7表现为

15、6条带,见图1 。样本1 P C R产物纯化后测序其第1 8 7位碱基为C , 基因型 判为C 8 A*AA,样本5P C R产物测序第1 8 7位碱 基为A,基因型判为C 8 A*B B ,样本3 、 4 、 6 、 7基因 型为杂合子C 8 A*AB ,见图2 。采用此方法对成都 地区汉族群体9 8份样本D NA C 8 A基因型频率分 布 进 行 调 查, C 8 A* AA= 2 4 . 4 9 %, C 8 A* B B= 2 0 . 4 1 %, C 8 A*AB =5 5 . 1 0 %,见附表,在这些个体 图1 P C R - S S C P电泳图 F i g1 T h er

16、e s u l t s o f P C R - S S C Pe l e c t r o p h o r e s i s 1 - 8 :S a mp l e ;M:D NAma r k e r 图2样本1 ( A ) 、样本5 ( B ) P C R产物测序图 F i g2 T h es e q u e n c i n gr e s u l t s o f P C Rp r o d u c t o f s a mp l e1 ( A ) ,s a mp l e5 ( B ) : T h el o c a t i o no f mu t a t e db a s e 附表成都汉族群体中C 8 A

17、基因型分布及Ha r d y - We i n b e r g平衡 检验 T a b l e D i s t r i b u t i o no fg e n o t y p e sf r e q u e n c i e sa n dHa r d y - We i n b e r g e q u i l i b r i u m o f C 8 Ai nC h e n g d uHa np o p u l a t i o n G e n o t y p e Ob s e r v e d v a l u e G e n o t y p e f r e q u e n c y ( %) AA2 42

18、4 . 4 9 B B2 02 0 . 4 1 AB5 45 5 . 1 0 T o t a l9 81 0 0 x 2=1 . 0 5 8 P =0 . 3 0 5P 0 . 0 5 中没有发现稀有等位基因。在成都地区汉族群体中, 所 观 测 到 的 C 8 A基 因 型 频 率 分 布 符 合Ha r d y - We i n b e r g平衡定律( P0 . 0 5 ) 。 3 讨论 从 C 8 A多态性相关的文献可知, C 8 A*AA、 C 8 A*B B及C 8 A*AB是所有人群中最常见的基 因型 3 ,这在我们的实验中也得到证实。虽然,迄今 为止已有十余种稀有亚基的报道,但本

19、实验采用 274 四川大学学报(医学版)2 0 0 6年第3 7卷第3 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 期 P C R - S S C P方法并没有检测出稀有亚型, 这可能一 是与检测的样本量不够大有关,二是稀有亚型所发 生的范围突变并不在第三外显子的范围内,因而不 可能被检出。 目前,检测点突变的方法主要有核酸序列分析、 等位基因特异性探针杂交技术、聚合酶链反应-

20、限制 性片段长度多态性( P C R - R F L P ) 、 P C R - S S C P 、变性 高效液相色谱( D HP L C )等,其中核酸序列分析是最 准确的点突变分析方法。P C R - S S C P与核酸序列分 析技术相比,主要有以下特点 4 , 原理和操作简 单,技术容易掌握; 成本低,使用试剂价格低廉; 实验步骤少,周期短; 适用于大样本的筛查。缺点 是: 不能检测基因突变的位置; 在P C R产物污 染的情况下可出现假阳性结果, S S C P分析条件未 得到最佳优化时,易出现假阴性结果,准确性及灵敏 度均降低。但对于大样本,核酸序列分析价格昂贵, 而P C R -

21、 S S C P价格低廉,适于筛查大样本。所以,核 酸序列分析之前,能通过此法筛查出需测序的D NA 样本,则能大大降低盲目测序导致的人力、物力、财 力的损失。所以P C R - S S C P已经作为一种筛查点突 变的必要手段,广泛应用于种群生物学特征、遗传性 疾病等方面的检测。 P C R - S S C P准确性及灵敏度的提高主要是通过 设置对照及优化实验条件达到。实验条件的优化有: 控制P C R产物的纯度; S S C P电泳过程中选择适合 样本D NA分离的凝胶浓度、胶联度、电压、电泳温 度、电泳缓冲液和染色方法,还需要根据样本D NA 分离效果决定是否在凝胶中添加甘油、 P C

22、R产物稀 释的倍数与上样量等 5 。虽然P C R - S S C P技术自问 世以来,在方法学上和技术上不断完善,检测的灵敏 度也得到了不断提高,但对不同的研究对象,为了提 高P C R - S S C P准确性及灵敏度,仍需要在实验过程 中 不断优化实验条件。从本实验可看出,在最佳 P C R - S S C P分析条件下, P C R - S S C P方法检测C 8 A D NA基因型准确性及灵敏度较高, 又具有快速、易 操作,成本低廉等优点,在法医学实践和群体遗传学 研究中对大样本的筛查具有较好的应用价值。 参考文献 1 张林,辛军平,李荣华等.用等位基因特异扩增技术检测人类 补 体

23、 第 八 成 份C 8 A D NA多 态 性 的 研 究.中 国 法 医 学 杂 志, 2 0 0 1 ; 1 6 ( 3 ) : 1 3 6 - 1 3 8 . 2 金东雁,黎孟枫主译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出 版社, 1 9 9 2 : 9 5 5 - 9 5 6 . 3 张林,裴黎,李荣华等.中国汉族群体人类补体C 8 A多态 性.中国法医学杂志, 2 0 0 0 ; 1 5 ( 2 ) : 7 2 - 7 4 . 4 姚海军,曹虹,郭辉玉. P C R - S S C P分析法及其研究进展.生物 技术, 1 9 9 6 ; 6 ( 4 ) : 1 - 4 . 5T e

24、me s g e nZ ,S a t o hK,Uh LJ R ,e t a l . Us eo f p o l y me r a s ec h a i n r e a c t i o ns i n g l e - s t r a n dc o n f o r ma t i o np o l y mo r p h i s m ( P C R - S S C P ) a n a l y s i st od e t e c t a p o i n t mu t a t i o ni nt h e a t a l a s e - p e r o x i d a s e g e n e ( k a t

25、 G)o fMy c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s . Mo l C e l l P r o b e s , 1 9 9 7 ; 1 1 : 5 9 . ( 2 0 0 50 72 1收稿, 2 0 0 51 01 3修回) 编辑沈进 本刊征稿启事 四川大学学报(医学版) (原华西医科大学学报 )是中文科技核心期刊,曾荣获全国优秀科技期刊一等奖、首届国家期 刊奖提名奖、第二届国家期刊奖百种重点期刊和四川省十佳科技期刊称号。并被美国医学索引 ( I ND E XME D I C US ,I M/ ME D L I NE) 、 生物学文摘

26、( B I OL OG I C ALAB S T R AC T S , B A) 、 化学文摘 ( C HE MI C ALAB S T R AC T S , C A) ,荷兰医学文 摘 ( E X C E R P T A ME D I C A, E M) ,俄罗斯文摘杂志 ( AJ ) ,中国科技论文与引文数据库( C S T P C D ) ,中国生物医学文献光盘 数据库( C B Md i s c ) ,中文生物医学期刊文献数据库( C MC C ) ,中国学术期刊网全文数据库( C NKI ) ,中国学术期刊(光盘版) ,万 方数据-数字化期刊群等数据库收录。 为了更好地开展国内外学术

27、交流,促进医药卫生事业的发展,现四川大学学报(医学版) 可对外征稿,凡符合编辑部稿 件要求(见稿约) ,均可向本刊投稿。凡属于国家自然科学基金及其他科研基金资助的来稿,编辑部将适当地给予优先。来稿请 一式两份,电脑打印,并请附上联系电话及E - ma i l 。稿件寄编辑部收,请勿寄给个人。 用英文撰写的稿件投稿时应附上中文稿。英文稿一经采用,刊出时间可提前。 地址:四川省成都市人民南路三段1 7号四川大学学报(医学版)编辑部 邮政编码: 6 1 0 0 4 1 电话/传真: ( 0 2 8 ) 8 5 5 0 1 3 2 0 E - ma i l :h u a x i 1 1 ma i l . s c . c n i n f o . n e t 四川大学学报(医学版)编辑部 374JS i c h u a nUn i v( Me dS c i E d i )Vo l . 3 7No = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = . 32 0 0 6