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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 1 8 1 . 2 - 2 0 0 3 口蹄疫病毒抗体检测方法 微量血清中和试验 D e t e c t i o n a n t i b o d i e s a g a i n s t f o o t a n d mo u t h d i s e a s e v i r u s - Pr o t o c o l o f mi c r o - s e r u m ne u t r a l i z a t i o n t e s t 2 0 0 3 - 0 3 - 1 7 发布 2 0 0 3 - 0 9 - 0 1实施 中华人民共和
2、匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 肩 S N / T 1 1 8 1 . 2 -2 0 0 3 曰 出 . 吝 月g青 本标准根据采用 O I E 诊断试验与疫苗标准手册 2 0 0 0 年第四版 2 . 1 . 1 章的相关内容起草。 本标准的附录A、 附录 B是标准的资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 杨素、 薛景山、 吕宏、 冯家望。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N/ T 1 1 8 1 . 2 -2 0 0 3 口蹄疫病毒抗体检测方法微量血清中和试验 范围
3、本标准规定了口蹄疫病毒微量血清中和试验方法。 本标准适用于口蹄疫病毒中和抗体水平的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是往日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或 修订 版均不 适用于 本标准， 然而， 鼓励根据 本标准 达成协 议的各方 研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格及试验方法 3 缩 略语 下列缩略语适用 于本标 准。 3 . 1 C P E 致细胞 病变作用 。 3 . 2 T C I D50
4、 半数细胞感染量 。 3 . 3 F M D 口蹄疫 。 原理 特异性的血清中和抗体与病毒结合后， 能使病毒失去对敏感细胞的感染能力， 从而阻止病毒的繁 殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和， 而且还表现在中和一定量的病毒， 必 须有一定效价的 免疫血清。本标准规定的中和试验是以 定量 病毒稀释血清为基础， 当血清能阻止定量 病毒 5 0 %致细胞病变能力时， 其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定口蹄疫血 清抗体的方法。 5 试剂和材 料 5 . 1 本标准所用水应符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中关于三级水( 三蒸水) 的规格。 5
5、 . 2 本标准所用试剂配方参见附录 Ae 5 . 3 本标准试剂除特殊规定外， 均指分析纯试剂。 5 . 4 本标准所用试剂、 玻璃器皿除有特殊规定外， 均需高压灭菌。 5 . 5 病毒选用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的 0, A, C, S A T i , S AT 2 , S A T 。 和 A s i a 1 型口蹄疫细胞毒 分别作为各型血清抗体检测的标准毒。 1 S N/ T 1 1 81 . 2 -2 0 0 3 5 . 6 标准 血清: 标准阴性血清采 用无口 蹄疫病毒抗体的 猪血清或牛血清， 标准阳 性血清采用口 蹄疫病 毒感染发病 2 1 d 的康复猪血清或牛血清。 5 . 7
6、 细胞系: I B - R s - 2 或 B HK - 2 1 细胞系。 5 . 8 细 胞培养基: 含 1 0 %无口 蹄疫病毒抗体的胎牛血清( 经5 6 C , 3 0 m i n 灭能) 及抗生素的细胞培 养液。 5 . 9 细胞维持液: 含 2 %无口蹄疫病毒抗体的胎牛血清( 经 5 6 0C , 3 0 m i n 灭能) 及抗生素的细胞培 养液。 5 . 1 0 细胞分散液。 5 . 1 1 固定液的配制: 1 0 %甲醛( 9 0 0 mL生理盐水+1 0 0 mL甲醛) 。 5 . 1 2边仍 液的配制 . 1 0 0 0 mL固宁液 +0 . 5亚甲储 6 器械和设备 6
7、. 1 二氧化碳培养箱、 微量振荡器、 倒置显微镜、 冰箱( -2 0 保存血清， -7 0 保存种毒) 。 6 . 2 1 0 0 mL细胞培养瓶、 9 6 孔微量细胞培养板、 吸头、 多道可调移液器、 单道可调移液器。 预备试验 7 . 1 将口蹄疫病毒 O, A, C, S AT , , S A T , , S AT , 和 A s i a 1 型分别接种 I B - R s - 2 或 B HK - 2 1 细胞单层， 3 7 吸附1 h 后加人维持液， 置5 %二氧化碳培养箱于3 7 培养， 接种2 4 h 后用倒置显微镜逐日 观察， 待C P E 达7 5 %以上， 冻融一次或置水
8、浴中 用超声波处理( 4 0 u A , 1 m in ) , 2 0 0 0 r / m i n 离心2 0 m i n ， 上清 液分装小瓶， 每瓶 1 mL， 置一7 0 保存备用。 7 . 2 病毒毒价的测定及其工作浓度的配制: 将病毒原液用细胞维持液做 1 0 倍系列稀释至 1 0 - m， 每个 稀释 度作4 个孔， 每孔5 0 I L L ， 每孔加5 0 A L细胞悬液( 含1 0 个细胞/ m L ) ， 再补充细胞维持液5 0 p L . 每块板设 4 孔正常细胞对照， 于5 %二氧化碳培养箱 3 7 培养， 从4 8 h开始至 1 6 8 h用倒置显微镜逐日 观察记录C
9、P E按 K a r b e r 方法计算 T C I D s o 。将病毒原液配制成 1 0 0 T C I D s o / 5 0 p I ， 待用. 7 . 3 将标准阳性血清、 阴性血清、 被检血清经 5 6 0 C 3 0 mi n 灭能， 待用. 7 . 4 将细晌用细响培养液稀释 成 1 0 “个细胞/ mL, 待用 中和试验 81 对照设立 8 . 1 . 1 细胞对照: 设 4孔正常细胞对照， 每孔加细胞悬液 5 0 p L ( 含 1 0 个细胞/ m L ) 、 细胞维持液 1 0 0 p L o 8 . 1 . 2 阳性对照: 将已知滴度的标准阳性血清用细胞维持液在 9
10、 6 孔微量培养板上从 1: 4开始做对倍 系列 稀释， 每 个稀释度作4 个孔， 每孔加各稀释度阳性血清和1 0 0 T C I D so / 5 0 p L 病毒悬液各5 0 K L , 微 量振 荡器振荡棍匀， 置3 7 中和I h ， 再加人细胞悬液5 0 p L ( 含1 0 , 个细 胞/ m L ) , 8 . 1 . 3 阴性对照: 设4 孔阴性血清对照， 每孔加阴性血清和 1 0 0 T C I D s o / 5 0 V L病毒悬液各5 0 p L ， 再加 人细胞悬液 5 0 K L( 含 1 0 个细胞/ m L ) e 8 . 1 . 4病 毒 回 归 对 照 :将
11、各 型 病 毒 稀 释 为1 0 0 6 , 1 0 0 , 1 0 , 1 T C ID so / 5 0 p L ，每 个 稀 释 度 作4 孔 ， 每 孔 加 人病毒悬液 5 0 p L， 再加人细胞悬液 5 0 I. L ( 含 1 0 个细胞/ m L ) ， 每孑 L 补充细胞维持液 5 0 y L , 8 . 1 . 5 血清毒性对照: 被检血清每个稀释度设1 孔血清毒性对照， 即5 0 川一 各稀释度血清， 补充5 0 川 维持 液， 再加人细胞悬液5 0 p L ( 含1 0 个细胞/ m L ) , 8 . 2 试验步骤 将待检血清用细胞维持液在微量培养板上从 1， 4开始
12、做对倍系列稀释， 每个稀释度作 5孔， 每孔 5 0 u L 。被检样每个稀释度 4孔加人预备试验滴定好工作浓度的病毒悬液 1 0 0 T C I D s o / 5 0 p L ， 微量振 S N / T 1 1 8 1 . 2 -2 0 0 3 荡器振荡 混匀， 置3 7 中 和1 h ， 再加人细胞悬液5 0 y L ( 含1 0 个细胞/ m L ) 。于含3 % - 5 % 二氧化碳 的 培养箱中3 7 1C 培育2 d - 3 d . 4 8 h 用倒置显微镜初判， 7 2 h 终 判， 终判前需固定染色。 8 . 3 终判定前的固定染色 弃去 培养基， 每孔加5 0 K L固 定
13、液， 固 定3 0 m i n 。 弃去固 定液， 将板浸人染色液中3 0 m i n 。自 来水 冲洗， 观察结果， 8 . 4 结果判定 8 . 4 . 1 结果判 定需以 对照成立为前提， 当病毒回 归为I g l . 5 -1 g 2 . 5 ， 标准阳性血清效价与原滴定效价 相差1 个滴度以内， 参考阴性血清对照孔为空白， 细胞对照孔细胞染成蓝色时， 才能进行终判。 8 . 4 . 2 细胞层 染成蓝色的 孔判为阳性， 细胞层为空白时判为阴 性。血清效价以5 0 % 终点血清与病毒 混合液中血清的总稀释度表示。 8 . 4 . 3 对试验结果的说明: 由于实验室之间对终点的确定会有不
14、同， 或不同操作人员之间对病毒定量 和血清稀释以及使用的试剂不同， 因而常会造成试验结果的差异， 所以各实验室可通过 OI E / F A O世界 F MD参考实验室提供的标准试剂做参考来建立自己的标准。世界参考实验室的判定标准参见附录B . S N/ T 1 1 8 1 . 2 -2 0 0 3 附录A ( 资料性附录) 溶液配方 A . 飞 细胞培养液的基本要求 E a g l e s 最低要素培养基 H a n k s 液配 制的。 . 5 %水解乳蛋白 无口蹄疫病毒抗体的犊牛血清 3 %谷氨酞胺 抗生素( 参照A . 2 选用) 5 % 碳酸氢 钠( N a H C O , ) 调p
15、H至7 . 2 抽滤除菌 4 4 % 4 4 Y o 1 0 % 1 % 1 % A . 2 抗生素选用及工作浓度参考表( 每毫升培养液含量) 两性霉素 B 制霉菌素 庆大霉素 卡那霉素 新霉素 青霉素G 硫酸链霉素 多黯菌素B 1 . 2 5 p g 1 0 0 I U 5 0 jag 5 0 p g 5 0 pg 1 0 0 I U- 2 0 0 I U 1 0 0 p g -2 0 0 p g 1 0 0 I U A . 3 细胞分散液 胰酶 乙二胺四乙酸二钠( E D T A) 无钙镁P B S 抽滤除菌 2 . 5 g 0 . 2 g 0 0 0 M I S N / T 1 1 8 1 . 2 -2 0 0 3 附录B ( 资料性附录) 世界参考实验室判定标准 在5 0 % 终点， 血清与 病毒混 合液中 血清的总 稀释度为1 : 4 5 或 1 . 4 5 以 上为阳性; 1 : 1 6 至1 : 3 2 为可 疑， 应重新采血检测.重新采血检侧时， 5 0 % 终点血 清与 病毒混合液中血 清的总 稀释 度大于 或等于 1， 1 6为阳性; 1， 8或1: 8以下为阴性。