《SN-T 1151.4-2003 对虾黄头病毒(YHv)逆转录 聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN-T 1151.4-2003 对虾黄头病毒(YHv)逆转录 聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf.pdf（7页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 对虾黄头病毒( Y H v ) 逆转录 聚合酶链式反应( R T - P C R ) 检测方法 P r o t o c o l o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( R T - P C R ) f o r y e l l o w h e a d v i r u s o f s h r i m p ( Y H V ) 2 0 0 3 - 0 5 - 2
2、 8 发布2 0 0 3 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监督 检 验 检疫 总 局 发 布 S N / T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 .岛 召. 月 月 q青 本标准的附录A是规 范性附录， 附录s 是资 料性附录。 本 标准由国家 认证认可监 督管理委员 会提出 并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 刘左、 史秀杰、 高隆英、 江育林。 本标准系 首次发布的 检验检疫行业标准。 S N/ T 1 1 51 .4 -2 0 0 3 对虾黄头病毒( YH V ) 逆转录 聚合酶链式反应( R T - P
3、 C R ) 检测方法 1 范围 本标准规定了用逆转录聚合酶链式反应技术检测对虾黄头病毒的方法。 本标准 适用于 对虾黄头病毒的 鉴定及其流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9
4、8 7 ) 3试荆和材料 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 6 3 . 7 3 . 8 3 . 9 2 4 2 4 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 4 . 8 4 . 9 水: 应符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中一级水的规格。 T a q 酶: -2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化。 逆转录酶AMV: -2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化. 核糖核酸酶抑制剂( R N a s in ) : 一2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化。 d N T P ( 含d C T
5、 P , d G T P , d A T P , d T T P各 1 0 m mo l / L ) , 引物: 浓度为 4 0 k mo l / L 。其序列如下: 上游引物 1 0 F : 5 - C C G C T A A T TT C A AA A AC T AC G - 3 下游引物 1 4 4 R: 5 - AA G G T G T T AT G T C G AG G A A G T - 3 异丙醉: 分析纯， 使用前预 冷到一 2 0 0 C , 矿物油: 要求无 D N A酶和 R N A酶。 标准分子量: 推荐使用p U C 1 9 D N A / M s p I H p a
6、 II ) ， 各片段大小依次为5 0 1 b p , 4 0 4 6 p , 3 3 1 b p , 6 p , 1 9 0 6 p , 1 4 7 b p o 器材和设备 P C R扩增仪。 电泳仪。 微量移液器及吸头。 紫外观察灯。 恒温培养箱。 普通冰箱和低温冰箱。 电动匀浆器。 离心机和离心管。 制 冰机。 取样和 制样 5 . 1 取样 S N/ T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 5 . 1 . 1 取新鲜的 对虾组织作为祥品。 处理前要将样品 放在冰上。 如果2 h 以后才能处理， 宜 将样品保 存在无 水乙醇中， 无水乙 醇体积是样品体积的1 0 倍以上， 可放置在
7、室温下保存4 个月。血淋巴 样品需 保存在一7 0 r , 5 . 1 . 2 对于仔虾或稚虾， 取整只虾或虾头作样品。取虾头时， 用灭菌剪刀和 镊子去除眼睛、 头胸甲、 所 有的胸部附器和头部以后的腹部。 5 . 1 . 3 对于成虾， 取鳃丝、 淋巴器官或血淋巴作为样品. 5 . 1 . 3 . 1 取鳃丝时， 用灭菌剪刀剪去头部两 侧的 头胸甲， 露出鳃丝， 然后用剪刀剪取鳃丝。 5 . 1 . 3 . 2 取淋巴器官时， 要除 去头 部以 后的 腹部， 并切除头胸甲 前方的嚎部。 从头 胸甲中 间， 将头 胸部 分为两 部分， 暴露出内 部的组织器官。 在胃 的腹侧、 肝胰腺的 后面，
8、 取出白 色、 呈二裂片状的淋巴 器官. 5 . 1 . 3 . 3 取血淋巴时， 先用1 m L针管吸取5 0 0 p L 1 0 %的柠檬酸盐溶液( 见附录A中第A . 1 章) ， 然 后在针管前插上一个 2 6号的针头。抓住对虾， 使腹部朝上将针头水平地插人第一和第二对游泳足之 间， 并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。 5 . 2制样 在 1 5 下， 在 1 . 5 m L P C R管中首先加人 2 5 mg -1 0 0 mg 组织或 2 0 0 I. L血淋巴柠檬酸盐混合液， 再加人1 5 0 p L C T A B 溶液( 见附录A中 第A . 2 章) ，
9、 用小剪刀剪碎， 然后用均浆器将样品 均浆成糊状。 再加C TA B溶液到 9 0 0 p L a混匀后置于 2 5 作用2 h . Y H V核酸的鉴定 6 ， I 核酸抽提 首先加 6 0 0 K L抽提液 1 ( 见附录A中第 A. 3 章) ， 充分混合至少 3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / m i n离心 5 mi n ， 取 上层水相。再加 7 0 0 K L抽提液2 ( 见附录A中第A . 4 章) 。 充分混合 3 0 s ; 1 2 0 0 0 r / min离心 5 mi n ， 取 上层水相。 然后加人1 . 5 倍体积的一2 0 无水乙 醇， 混匀 后， -
10、2 0 放置6 h 以上。1 5 0 0 0 r / m i n 离心 3 0 m i n ， 弃上清， 立即 用滤纸吸 干， 3 7 干燥2 0 m in 。 最后加1 0 p L水 溶解后， 作为P C R模板， 6 . 2 变性和退火 在P C R 管中 加人1 0 p L 模板和5 p L引物( 上游引物和下游引物各2 . 5 y L ) ， 置于7 0 反应5 m i n , 立即冰浴， 低速离心约5s ， 使液体集中在底部。 6 . 3 c D N A合成 在上述反应管中继续加人d N T P 2 p L , 5 倍逆转录酶缓冲液( 见附录A中第 A . 6章) 5 p L , R
11、 N A抑 制剂( 8 0 U ) 0 . 5 A L 、 无菌蒸馏水1 . 5 p L ， 再覆盖5 0 p L 矿物油。 将P C R管置于 P C R扩增仪。3 7 反应 1 0 m i n后， 再加人 1 I L逆转录酶 AMV( 2 0 U ) 并低速离 心。4 2 0C 6 0 mi n 反应制备模板的c D N A。反应结束后， 7 0 0 C, 1 0 min灭活逆转录酶， 立即冰浴. 6 . 4 P CR扩增 DNA 在上 述反应管中再继续 加人T a q 酶1 p L , d N T P 1 p L ， 反向引 物和正向 引物各1 p L , 2 5 m m o l / L
12、 的 氯化镁( Mg c l , )见附录A中 第A . 8 章) 1 0 p L , 1 0 倍T a q 酶浓缩缓冲液( 见附 录A中 第A . 9 章) 1 0 p L , 加水到总体积 1 0 0 p L , 馄匀后低速离心， 让矿物油在上层。 再将反应管置于P C R扩增仪 先9 4 0 C , 4 m i n ， 再开始3 5 次循 环( 核酸变性 9 4 0C , 1 mi n ; 引物退火5 8 C, 1 mi n ; 延伸 7 2 0 C, 1 m i n ) ， 然后7 2 下延伸 1 0 mi n ， 最后 4 0 C 保温。 65 设立对照 6 . 5 . 1 在6 .
13、 1 中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、 阴性样品对照、 空白对照。 6 . 5 . 2 取含有已知 X HV的病毒标准株的对虾组织悬液作为阳性对照( 阳性对照物由国家质量监督检 验检疫总局指定单位提供) 。 6 . 5 . 3 取正常的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。 S N/ T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 6 . 5 . 4 取等体积的水代替模板作为空白对照。 6 . 6 琼脂糖电泳 用T B E ( 见附录A中第A . 5 章) 电泳缓冲液配制2 写的 琼脂糖( 含。 . 5 p g / m L E B ， 见附录A中 第 A . 6 章) 平板。 将平板放人水平电泳
14、槽， 使电 泳缓冲液刚好淹没胶面。 将6 K L 样品缓冲 液按比例混匀 后加人 样品孔。 在电 泳时 设立D N A标准分子量作对照。5 V / c m电 泳约。 . 5 h ， 当澳酚蓝到达底部时 停止。 7 结果判定 川在紫外灯下观察核酸带并判断结果. 7 . 2 P C R 后阳 性对照会出现一条1 3 5 b y 的D N A片 段， 阴性对照和空白 对照没有该核酸 带。 7 . 3 待测样品电泳后在 相应 1 3 5 b y D N A位置上有带者， 取P C R扩增产物测序， 同 参考序列( 参见附 录B ) 进行比较， 序列相似性在 9 5 %以上， 可判断待测样品结果为阳性。
15、 7 . 4 无带或带的大小不是 1 3 5 b y 的为阴性。 S NI T 1 1 5 1 . 4 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 试荆配制 A. 1 柠橄酸盐溶液 1 0 . 0 g 柠檬酸钠加 9 0 . 0 mL蒸馏水溶解。 A . 2 C T A B溶液 按2 %C T A B , 1 . 4 m o l / L抓化钠( N a C I ) , 2 0 . 0 m m o l / L E D T A , 2 0 . 0 m o l / L T r i s - H C I p H 7 . 5 配制. 用前加琉基乙醇到终浓度为0 . 2 5 0 0 , A . 3 抽提液
16、1 三抓甲烷/ 异戊醇( 将三氯甲烷和异戊醇按 2 4 : 1的比例混合， 密闭避光保存) 。 A . 4 抽提液 2 酚/ 三氛甲烷/ 异戊醇( 用 1 . 0 m o l / L p H 7 . 9 士0 . 2 T r i s 饱和过的重蒸酚 ， 三氯甲烷 异戊醇按 2 5 : 2 4 : 1 的比 例混合， 密闭 避光保存) 。 A . 5 T B E电泳缓冲液( 5倍浓缩液) Tr i s 5 4 . 0 g 硼酸2 7 . 5 g EDTA 2 . 9 g 加水到1 0 0 0 . 0 mL 用 5 . 0 m o t / L的盐酸( HC l ) 调 p H到8 . 0 . A
17、. 6 E B ( 核酸染色荆) 用水配制成 1 0 . 0 mg / mL的浓缩液。用时每 1 0 . 0 mL电泳液或琼脂中加1 . 0 1 L , A . 7 级化镁( Mg c l 2 ) 2 5 . 0 mmo l / Lo A . 8 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液( 1 0 x b u f f e r ) Tr i s - HCI 氯化钾( K C 1 ) Tr i t o n X - 1 0 0 5 0 0 . 0 m mo l/ L p H8 . 8 5 0 0 . 0 mmo l/ L 1 % A. 9 T a q酶 5 U/ k L S N/ T 1 1 5 1 .4 -2 0 0 3 附录B ( 资料性附录) Y HV特异性片段的序列 1 CC GC TAATTT C AAAAAC TAC GAC AGAAAC A CCGGC ATGTC CTGTTCT CTC 5 1 ACTGAATTC C AGC TCTC TC T CTC TCAC ATC CTC TAC CGTT CTGAAGC ACA 1 0 1 G C GTACTC CT GACGACTTC C TCGAC A TAAC ACC TT