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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N I T 1 3 7 6 . 1 -2 0 0 4 牛传染性胸膜肺炎病原分离鉴定 I s o l a t i o n a n d i d e n t i f ic a t i o n o f c o n t a g i o u s b o v i n e p le u r o p n e u m o n i a 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 IK S N/ T 1 3 7 6 . 1 -2 0 0 4 前言 本标准的附录 A
2、是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国四川出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 李玉冰、 严玉宝、 曹同雪、 曹宗君、 胡娟、 马勇。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 3 7 6 . 1 -2 0 0 4 牛 传 染 性 胸 膜 肺 炎 病 原 分 离 鉴 定 范 围 本标准规定了牛传染性胸膜肺炎病原的分离与鉴定方法。 本标准适用于牛传染性胸膜肺炎病原的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准中引用而成为本标准的条款。凡是注 日 期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容
3、) 或修订版均不适用本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 设备 灭菌拭子。 恒温培养箱。 普通显微镜 。 穿刺针及注射器。 净化工作台。 .内乙q 3主段段3. 3 . 5 4培养基 4 . 1 试验用培养基包括运输培养基、 1 0 %马血清肉汤培养基、 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基、 普通 1 0 % 马血清肉汤琼脂培养基、 葡萄糖生化培养基、 精氨酸生化培养基和四氮哇盐生化培养基。 4 . 2 培养基配制方法见附录
4、Aa 4 . 3宝睑用A (,!r 符合 GB/ T 6 6 8 2 -1 9 9 2中的二级水标准 5 样品的采集、 运输和保存 5 . 1 活牛的样品采集 用灭菌拭子采集鼻分泌或用注射器无菌穿刺采取胸腔液。 5 . 2死牛的样品采集 无菌采取肺部病变组织、 肺部淋巴结、 胸腔液、 有关节炎的采取关节滑液。 5 . 3样品的运输 样品需长途运递的应将其置于运输培养基内， 于 4 条件下 4 8 h内送达实验室。 5 . 4样品的保存 采集的样品无法立即送实验室的或者实验室不能立即检验的， 应将样品置一2 0 保存。 6 病原分离培养 6 . 1 样品的处理 6 . 1 . 1 污染样品: 将
5、病料置于含5 0 0 I U/ mL青霉素及 1 ， 7 0 0 0乙酸铭的肉汤中磨碎， 1 0倍稀释后4 0 C 过夜， 供接种用。 S N/ T 1 3 7 6 . 1 -2 0 0 4 6 . 1 . 2 无污染样品: 无菌抽取的胸腔液、 关节滑液可直接接种。 6 . 2 样品的接种 6 . 2 . 1 取。 . 1 mL - 0 . 3 m L样品无菌接种于5 管 1 0 %马血清肉汤培养基中， 置3 7 培养直至第 1 0 d e 6 . 2 . 2 用无菌接种环钩取样品划线接种于 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基上， 每个样品共接种 5 个培养 皿。每个培养皿用胶布或者蜡封口， 置
6、3 7 培养直至第 1 0 d o 6 . 3生长观察 6 . 3 . 1 接种后第 3d 开始每天观察接种管及培养皿细菌生长情况直至第1 0 d . 6 . 3 . 2 在1 0 %马血清肉汤试管中， 牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为: 初期呈轻微混浊或白色点状 或丝状， 后逐渐均匀混浊， 呈半透明稍带乳光， 无菌膜或沉淀， 也无颗粒悬浮。 6 . 3 . 3 在 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基上， 牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为: 生长迟缓， 为水滴状 圆形略带灰色的微小菌落， 中央有乳头状突起， 呈“ 煎蛋” 样外观， 菌落直径约0 . 2 mm -2 . 0 m m. 6 . 4 将
7、可疑菌落或可疑肉汤培养物接种于普通 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基， 培养3d -4d ， 连传三代 进行纯化， 供病原鉴定用。 7 病原鉴定 7 . 1 培养特性 7 . 1 . 1 挑取菌落接种 1 0 %马血清肉汤培养基中3 d -5 d 后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原生长表 现如 6 . 3 . 2所述。 7 . 1 . 2 挑取菌落接种在普通 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基上， 3d -5d 后观察结果。牛传染性胸膜肺 炎病原生长表现如6 . 3 . 3 所述。 7 . 2 染色镜检 挑取典型菌落， 涂于玻片上， 自然干燥， 用 5 0 0 铬酸水溶液固定 2 m i n ， 水洗
8、， 浸人用蒸馏水 1: 3 0稀 释的姬姆萨氏染色液， 4 过夜， 取出用蒸馏水轻轻冲洗， 自然干燥后用8 0 0倍1 0 0 0倍显微镜观察。 病原在显微镜下表现为多形态， 以球形最常见， 也可见杆状、 丝状、 环状、 星状者， 长度为 1 2 5 n m- 2 5 0 n m . 7 . 3 生化试验 挑取纯化菌落分别接种葡萄糖生化培养基、 精氨酸生化培养基和四氮哇盐生化培养基， 3 7 培养 3 d -5 d 后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原能分解葡萄糖产酸变色但不产气; 不能分解精氨酸， 试验 管不变色; 能还原四氮哇盐 ， 培养基 由无色变为红色 。 结果判定 符合第 7 章所列条件
9、的， 判为牛传染性胸膜肺炎病原体。 S N/ T 1 3 7 6 . 附录A ( 规范性附录) 培养基 A . 1 运输培养基 A . 1 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 m L , 酵母浸膏 1 0 0 g 、 琼脂 3 g 、 青霉素 5 0 0 0 0 0 I U、 乙酸花 0 . 1 4 g 、 马血清 2 0 0 mL , A . 1 . 2 培养基的配制: 先将乙酸蛇溶于 1 5 mL的无菌蒸馏水中; 牛心浸液中加人琼脂、 酵母浸膏， 煮沸 溶解后， 1 5 磅灭菌 1 5 mi n 。待培养基温度降至 3 7 以下时， 将乙酸铂、 青霉素及经 5 6 灭活 3
10、0 mi n 的 马血清加人其中， 混匀， 分装至无菌的容器中。经无菌检验后置 4 保存备用 A . 2 1 0 %马 血清肉汤培养基 A . 2 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 m L , 酵母浸膏 1 0 0 g 、 马血清 1 0 0 mL , 葡萄糖5 g , D NA 2 g 、 青霉 素5 0 0 0 0 0 I U、 乙酸锭 0 . 1 4 g , A . 2 . 2 培养基的配制: 先将乙酸铭溶于 巧 mL的无菌蒸馏水中; 牛心浸液中加人酵母浸膏、 葡萄糖， 煮 沸溶解后， 1 5 磅 灭菌1 5 m i n 。 待培养基温度降至3 7 以下时， 将乙酸蛇、
11、青霉素 及经5 6 灭活3 0 m i n 的马血清加人其中， 混匀， 分装至无菌的容器中。经无菌检验后置 4 保存备用。 A . 3 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基 A . 3 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 mL , 酵母浸膏 1 0 0 g 、 马血清 1 0 0 m L, 葡萄糖 5g 、 琼脂 1 2 g , D NA 2 g 、 青霉素5 0 0 0 0 0 I U、 乙酸锭 0 . 1 4 g , A . 3 . 2 培养基的配制: 将乙酸轮溶于 1 5 mL的无菌蒸馏水水中; 牛心浸液中加人琼脂、 酵母浸膏、 葡萄 糖， 煮沸溶解后， 1 5 磅灭菌1 5 m
12、i n 。将乙酸蛇、 青霉素及经5 6 灭活3 0 min的马血清, D N A加人其中， 混匀 ， 分装至无菌的容器 中。经无菌检验后置 4 保存备用 。 A . 4 普通 1 0 %马血清肉汤琼脂培养基 A . 4 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 mL , 酵母浸膏 1 0 0 g 、 马血清 1 0 0 MI 、 葡萄糖 5 g , D N A2 g 、 琼脂 1 2 g . A . 4 . 2 培养基的配制: 将葡萄糖、 酵母浸膏、 琼脂溶解于1 0 0 0 mL牛心浸液中， 经 1 0磅灭菌 1 5 m i n 后， 加人经 5 6 0C 3 0 m i n 灭活的
13、无菌马血清和D NA, 混匀， 分装至灭菌培养皿， 经无菌检验后置 4 保存 备用 。 AS 葡萄糖生化培养基 A . 5 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 mL 、 马血清 1 0 0 mL 、 酵母浸膏 2 5 0 g , l %酚红 5 mL , D N A 2 g , 5 0 %葡萄糖溶液 1 0 mL . A . 5 . 2 培养基的配制: 牛心浸液中加人酚红， 酵母浸膏， 煮沸溶解， 1 5磅灭菌 1 5 mi n ， 无菌加人D NA, 葡萄糖溶液和经5 6 灭 活3 0 m i n 无菌马 血清1 0 0 m L , 混匀， 无菌分装至无菌的生化试管中， 经无菌
14、 检 验后置 4 保存备用 A . 6 精氨酸生化培养基 A . 6 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 mL 、 马血清1 0 0 mL , 醉母浸膏2 5 0 g , l %酚红 5 mL , D NA 2 g , S N/ T 1 3 7 6 . 1 -2 0 0 4 3 8 %精氨酸盐溶液 4 0 mL , A . 6 . 2 培养基的配制牛心浸液中加人酚红、 酵母浸裔， 煮沸溶解， 1 5 磅灭菌 1 5 mi n ， 无菌加人D NA, 无菌的精氨酸盐溶液和经5 6 灭活3 0 mi n 无菌马血清， 混匀， 无菌分装至无菌的生化试管中， 经无菌 检验后置 4 保存备用。 A . 7 四氮哇盐生化培养甚 A . 7 . 1 培养基的成分: 牛心浸液 1 0 0 0 mL , 酵母浸膏 2 5 0 g 、 马血清 1 0 0 m L, D N A 2 g , 2 %四氮哇盐 1 0 mL. A . 7 . 2 培养基的配制: 牛心浸液中加人酵母浸膏， 煮沸溶解， 1 5 磅灭菌 1 5 m i n ， 无菌加人D NA、 四氮哇 盐和经 5 6 灭活 3 0 mi n 无菌马血清， 混匀， 无菌分装至无菌的生化试管中， 经无菌检验后置 4 保存 备用 .