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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 1 7 1 . 2 -2 0 0 3 山羊关节炎一 脑炎抗体检测方法 琼脂免疫扩散试验 D e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t c a p r i n e a r t h r i t i s - e n c e p h a l i t i s v i r u s ( C A E V ) -A g a r g e l i m mu n o d i f f u s i o n ( A G I D ) 2 0 0 3 - 0 3 - 1 7发布 2 0 0 3 -
2、0 9 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 I F. % S N/ T 1 1 7 1 . 2 -2 0 0 3 前言 本标准根据O I E / c h a p t e r 2 . 4 . 4 诊断试验和疫苗标准手册 起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 杨宝华、 崔路、 耿捷、 曾晓平。 本标准是首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N / T 1 1 7 1 . 2 -2 0 0 3 山羊关节炎一 脑炎抗体检测方法 琼脂免疫扩散试验 1 范 围 本标准规
3、定了应用琼脂免疫扩散试验检测山羊血清中抗山羊关节炎一 脑炎病毒抗体的方法。 本标准适用于山羊关节炎一 脑炎的流行病学调查、 诊断、 检疫和疫情监测。 2 试验原理 琼脂是一种含有硫酸基的多糖体， 高温时能溶于水， 冷却后凝固， 形成凝胶， 琼脂凝胶呈多孔结构， 其孔径大小取决于琼脂的浓度。1 %琼脂凝胶的孔径约 8 5 n m， 这一孔径范围能允许可溶性抗原抗体分 子在琼脂凝胶中自由扩散， 并由近及远形成浓度梯度， 当二者在比例适当处相遇， 即发生沉淀反应， 并形 成沉淀带。根据有无沉淀带的形成判断是否存在相应的抗原抗体免疫反应， 从而判断样品中是否存在 相应的抗体或抗原。 3 仪器与试验准备
4、 3 . 1 C A E琼脂扩散抗原和阳性对照血清 由指定单位提供。 3 . 2 琼脂馆凝胶板的制备 用T r i s - H C I 缓冲液配置0 . 9 %一1 %琼脂糖并制板: T r i s 0 . 6 0 5 g 和氯化钠( N a C U 8 . 0。 溶于 1 0 0 m L 蒸馏水中， 继用 1 mo l / L盐酸( H C U 溶液调p H至 7 . 2 ， 然后加人 。 . 9g - - lg琼脂糖， 隔水煮沸 溶解或高压溶解， 冷却至5 5 左右取约 1 5 mL 倒人直径为9 c m平皿制作琼脂糖凝胶板， 冷却后 4 保 存备用 。 3 . 3 采样与样品处理 无菌条
5、件下静脉采血 5 m 工 _ 左右， 将血样进行血清分离后， 经 5 6 水浴灭活3 0 mi n 后待检。 3 . 4 仪器 天平( 0 . 0 0 1 g ) 、 水浴锅、 琼脂凝胶打 孔器。 4 操作步骤 4 . 1 打孔 取冷却琼脂糖凝胶板用打孔模具按下列图示进行打孔， 孔径 5 m m， 孔距为 3 m m。打孔结束后将 平板底部经过酒精灯火焰上方， 来回5次一7 次封底( 适用于玻璃平皿) 。将所打的孔按图1进行编号 ( 1 - 6 ) 。 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 图 1 S N/ T 1 1 7 1 . 2 -2 0 0 3
6、 4 . 2加样 结 合图1 ， 用微量 取样器在中间 孔( B ) 加人C A E V 抗原， 第3 , 6 孔或图 示( + ) 内分别加人对照阳 性 血清， 第1 , 2 , 4 , 5 孔分别加人被检血清， 加人 量约每孔3 0 p L 或加满至 不溢出为度。加样完毕后， 将琼 脂板放在湿盒内， 置室温或 3 7 放置2 4 h -7 2 h , 2 4 h初判， 7 2 h 终判。 5 试验结果 的判定 5 . 1 阳性对照 阳性血清对照应与抗原孔中间形成一条清晰、 致密的沉淀线， 这时才能进行结果判读。 5 . 2 被检阳性 被检血清孔与抗原孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联， 判为阳性。 5 . 3 被检可疑 如沉淀线不清晰或只出现阳性对照沉淀线向被检血清孔间弯曲时， 判为可疑， 应予重检， 重检结果 相同应判为阳性. 5 . 4 被检阴性 无沉淀线出现为阴性。沉淀线与阳性对照沉淀线交叉或不相联时， 均属非特异性反应， 判为阴性。