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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 3 7 9 . 1 -2 0 0 4 猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验 P r o t o c o l o f t h e e n z y m e - l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y u s i n g mo n o c l o n a l a n t i b o d y f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t c l a s s i c a l s w i n e f e v
2、 e r v i r u s 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N/ T 1 3 7 9 . 1 -2 0 0 4 月 臼吕 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人: 许如苏、 郭奕亮、 肖德雄。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 3 7 9 . 1 -2 0 0 4 猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验 范 围 本标准规定了单克隆抗
3、体酶联免疫吸附试验( 间接法) 检测猪瘟抗体的方法。 本标准适用于猪瘟的检疫、 诊断和疫苗免疫监测。 仪器设备 2 . 5 酶标板。 可调移液器。 恒温培养箱。 电子天平: 感量0 . 0 0 1 g , 酶标检测仪。 ，.乃乙勺J三且 朽今2，J夕 试荆 31 诊断试剂 3 . 1 . 1 猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原。 3 . 1 . 2 猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原. 3 . 1 . 3 标准阴性血清。 3 . 1 . 4 标准阳性血清。 3 . ! . 5 酶标二抗( 兔抗猪! g G辣根过氧化物酶结合物) 。 3 . 2 被检血清: 无溶血、 无污染。 3 . 3 溶 液 3 . 3 . 1
4、 试验所需溶液包括: 包被液( p H 9 . 6 碳酸盐缓冲液) ; 磷酸缓冲盐水( P B S ) ; 磷酸缓冲盐水一 吐温( P B S - T ) 洗涤液; 稀释液( P B S - T - B S ) ; 邻 苯二胺( O P D ) 底物液: 使用前配制; 终止液( 2 m o t / L H, S O , ) . 3 . 3 . 2 溶液配制见附录 A a 注: 诊断试剂由中国兽药监察所生产。给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如 果有其他等效产品， 则可按其使用说明书使用 操作方法 4 . 1 包被 用包被液将猪瘟病毒( 强毒或弱毒) 单抗纯化酶联抗
5、原作1 0 0 倍稀释， 每孔加人1 0 0 川 _ ， 置湿 盒于 4 0C过夜。 4 . 2洗板 弃去孔内液体， 用洗涤液洗板三次， 每次 3 mi n -5 面n ， 甩干孔内残液， 于滤纸上拍打吸干。 S N 丫T 1 3 7 9 . 1 - 2 0 0 4 43 加被检血清和标准血清 用稀释液将待检血清作 4 0 0 倍稀释， 每孔加 1 0 0 I L 。同时将标准阴性、 阳性血清分别作 1 0 0倍稀 释作对照， 3 7 培育1 . 5 h - - 2 h , 4 . 4洗板 重复 4 . 2 。 4 . 5 加酶标二抗 用稀释液将兔抗猪 坛G - 辣根过氧化物酶结合物稀释至工作
6、浓度， 每孔加人 1 0 0 p L , 3 7 培育 1 . 5 h -2 h . 4 . 6 洗板 重复 42 。 4 . 7 加O P D底物溶液 每孔加人底物溶液 1 0 0 L ， 室温下避光反应 5 mi n -1 5 mi n . 4 . 8 终止反应 当标准阳性血清对照孔呈黄色， 标准阴性血清对照孔无色或略微显色时， 每孔加人5 0 p L终止液终 止反应， 5 mi n内测定光密度。 4 . 9 测定光密度 以标准阴性血清对照孔作空白调零， 于酶标仪上测定4 9 0 n m波长的光密度( O D) , 5判定标 准 5 . 1 在猪瘟弱毒酶联板上， 标准阳性血清对照孔 O 1
7、 ) 大于等于 0 . 2时， 试验成立， 按以下标准判定 结果 : O D大于等于 。 . 2 ， 为猪瘟弱毒抗体阳性; O L 小于。 . 2 ， 为猪瘟弱毒抗体阴性。 a)切 5 . 2 在猪瘟强毒酶联板上， 标准阳性血清对照孔 O D大于等于 。 . 5 时， 试验成立， 按以下标准判定 结果 : a ) O D大于等于 0 . 5 ， 为猪瘟强毒抗体阳性; b ) O D小于。 . 5 ， 为猪瘟强毒抗体阴性。 S N / T 1 3 7 9 . 1 -2 0 0 4 附录A ( 规 范性 附录) 溶液配制 A . 1 包被液( p H 9 . 6 碳酸盐缓冲液) 碳酸钠( Na ,
8、 C O , ) 1 . 5 9 g , 碳酸氢钠( N a H C 0 , ) 2 . 9 3 g ， 先加适量的双蒸水， 完全溶解后加双蒸水定 容至 1 0 0 0 mL , A . 2 磷酸缓冲盐水( P B S ) 磷酸氢二钠( Na 2 HP 0 , ) 2 . 1 3 g , 磷酸二氢钾( KH 2 P O , ) 0 . 2 g , 氯化钠( N a C ll8 . 0 g , 抓化钾( K C D 0 . 2 g ， 先加适量的双蒸水， 完全溶解后加双蒸水定容至1 0 0 0 m L , p H应为7 . 4 ， 否则， 须用3 m o l / L 氢 氧化钠调p H为 7 .
9、 4 , A . 3 磷酸缓冲盐水一 吐温( P B S - T ) 洗涤液 P B S 1 0 0 0 mL ， 吐温- 2 0 ( T w e e n - 2 0 ) 0 . 5 mL, 混匀。 A. 4稀释 液( P B S - T - B S ) P B S - T 1 0 0 mL ， 小牛血清 5 m L, 混匀。 A . 5 邻苯二胺( O P D) 底物液 A . 5 . 1 称取柠檬酸( CHa 0 7 H 2 0 ) 2 1 g ， 先加适量的双蒸水， 完全溶解后加双蒸水定容至 1 0 0 0 mL , 配成0 . 1 mo l / L柠檬酸液。 A . 5 . 2 称取磷
10、酸氢二钠( Na i HP 0 , 1 2 H , 0) 7 1 . 6 g ， 先加适量的双蒸水， 完全溶解后加双蒸水定容至 1 0 0 0 m L; 配成 0 . 2 m o l / L磷酸氢二钠( N a z HP O , 1 2 H 2 0) 液。 A . 5 . 3 取 A . 5 . 1 溶液2 4 . 3 mL , A. 5 . 2溶液 2 5 . 7 mL , 混匀。 A . 5 . 4 取邻苯二胺2 0 m g溶于2 0 mL A . 5 . 3 液中， 临用前加3 0 %双蒸水( H 0 , ) 0 . 0 7 5 mL ， 即成底物 液 A . 6 终止液( 2 m o l / L硫酸) 于 5 0 0 m L双蒸水中缓慢加人7 6 m L浓硫酸( 9 8 %) , 混匀。