SN-T 1439-2004 国境口岸埃博拉出血热检验规程.pdf.pdf

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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 4 3 9 - 2 0 0 4 国境口岸埃博拉出血热检验规程 E x a m i n a t i o n c o d e s f o r e b o l a h e m o r r h a g i c f e v e r a t f r o n t i e r p o r t 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国家 质 量 监督 检 验 检 疫 总 I FR S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 月U青 本标准的附录C 、 附录 D为规范性附录， 附

2、录A、 附录 B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国海南出人境检验检疫局、 中华人 民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人: 黄廷学、 黄健民、 关淳、 吴波、 黄春德。 本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 国境口岸埃博拉出血热检验规程 范 围 本标准规定了国境口岸埃博拉出血热的检验对象、 方法、 结果报告程序及阳性结果的处置原则。 本标准适用于国境口岸的埃博拉出血热实验室检验。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2 . 1 埃 博拉出 血热 e b o

3、l a h e m o r r h a g ic f e v e r 由埃博拉病毒引起的一种对人类生命健康威胁极大的烈性传染病。主要通过与病人及其排泄物等 接 触传染 ， 也可通过气溶胶传播。 对象 在人境人员中发现的埃博拉出血热染疫人及染疫嫌疑人。 灵长类动物( 来自 埃博拉出血热地区) 。 人体组织和器官( 来 自 埃博拉出血热地区) 。 33.1找 4标本的采集和处理 4 . 1 病人血清 早期病人血液标本( 在发病3d内) 及第二次血液标本( 在 3 周后) 采集， 冷藏条件下迅速送实验室， 当日分离血清。如不能立即做细胞培养， 血液标本应放人超低温冰箱( - 8 0 C) 或液氮罐内

4、保存。 4 . 2 病人体液、 排泄物 采集病人体液、 排泄物( 包括尿液， 精液， 阴道、 直肠、 鼻腔、 口腔、 眼结膜分泌物) 等在冷藏条件下迅 速送至指定实验室， 做病毒分离或其他检测用。 4 . 3 组织标本 采集死亡病例( 灵长类动物) 含有汗腺的皮下组织、 肝脏、 脾脏等， 在冷藏条件下迅速送至指定实验 室， 做病毒分离或其他检测用 4 . 4 标本标识与实验样品转运 4 . 4 . 1 标本标识 采集的标本应进行标识， 连同相关记录一并送实验室 4 . 4 . 2 实验样品转运 实验样品转运过程应遵循下列原则: 所有需要转运的实验样品必须标明“ 传染性物质， 埃博拉病毒” ;

5、短途运输必须使用专车， 由专人运送。尽可能避免长途转运， 如确需要空运的实验样品应按照 有关部 门对传染性物品运输 的规定办理 ; 样品的容器要使用能够承受不少于 9 5 k P a 压力的高质量的防水包装材料并且密封， 以防止运 输过程中发生内容物的外泄; 第二层和第三层包装中应使用吸水性好的柔软物质充填; S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 几个易碎的容器在同一个包裹中运输时， 应分别独立包装并相互隔离， 以免相互碰撞。 准备 常用仪器设备和器材参见附录 A， 常用溶液及配制参见附录B , 检验方 法 埃博拉出血热实验室的检验方法如下: 电子显微镜检查; 埃博拉病毒抗原检测;

6、病毒分离鉴定; 病毒核酸分子检测; 特异性抗体检测。 检验方法的详细内容遵照附录 C , 根据实验室设备条件及技术力量， 选择使用上述检验方法， 但其中应包括病毒学检验和抗体检测方 法中一项至两项 。 生物安全及防护措施 埃博拉出血热实验室的生物安全及防护措施按照附录D的规定操作。 检验结果报告 8 . 1 电子显微镜检查 电镜法检查阳性， 报告为“ 检出丝状病毒颗粒” ， 应采用免疫电镜技术做进一步鉴定。 8 . 2埃博拉病毒抗原检测 双抗体夹心抗原捕获 E L I S A法对( 血液、 尿液、 及皮下组织悬液) 标本检测阳性， 报告为“ 埃博拉病 毒抗原阳性” 。 8 . 3 病毒分离鉴定

7、 将含病毒材料接种细胞培养， 出现明显细胞病变， 并经间接免疫荧光法(U F A ) 鉴定证实， 报告为“ 检 出埃博拉病毒” ， 可以确诊。 8 . 4 病毒核酸分子检测 用反转录一 聚合酶链反应( R T - P C R ) 法从( 病人或病兽标本) 中检测到埃博拉病毒特异性 G P基因， 报告为“ 检出埃博拉病毒特异性G P基因” ， 可以确诊。 8 . 5 单份血清检测 单份血清标本特异性 坛M抗体 1， 4 0以上， 报告为“ 埃博拉病毒 坛M抗体阳性” ， 结合临床表现具 有诊断意义。 8 . 6 双份血清检测 患者双份血清特异性抗体检测， 恢复期血清抗体效价较急性期增高四倍及以上

8、时， 报告为“ 埃博拉 病毒抗体阳性” ， 可以确诊。 8 . 7间接免疫荧光试验( I F A ) 单份血清标本 1: 6 4 稀释呈阳性或双份血清效价增高四倍及以上时， 报告经间接免疫荧光试验证 实为“ 埃博拉病毒抗体阳性” ， 可以确诊. 8 . 8 免疫印迹试验( I B T ) 待检血清标本经免疫印迹试验同时出现NP和V P 3 0或NP和 V P 2 4显色区带， 报告为“ 埃博拉病 毒抗体阳性” ， 可以确诊。 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 9 阳性结果的处t 对病毒分离株及其他阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。阳性结果应及时向 上级主管部门报告

9、。 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 附录A ( 资料性附录) 常用实验设备和器材 A. 1 实验设备 按照国际标准建设， 并经相关部门组织专家全面验收合格的生物安全防护四级( B S L - 4或 P 4 ) 实验 室和相应的配套设施， 以及严格的工作规章制度。 A. 2 A. 2 . 1 A. 2 . 2 A. 2 . 3 A . 2 . 4 A. 2 . 5 A. 2 . 6 A. 2 . 7 A. 2 . 8 主要仪器 透射式电镜( 放大2 0 万倍) 和超薄切片机、 真空喷镀仪等。 落射式荧光显微镜、 倒置显微镜。 低温超速离心机( 1 0 0 0 0 0 g ) ,

10、超低温冰箱( 一8 0 ,C) 、 液氮储存罐。 Y - 射线照射装置。 P C R检测仪。 双门高压灭菌器、 熏蒸消毒柜。 电泳仪及垂直平板电泳槽、 转移电泳槽、 透射反射仪等。 A. 3细胞 培养用器 材 A. 3 . 1 A. 3 . 2 A. 3 . 3 A. 3 . 4 A. 3 . 5 A. 3 . 6 A. 3 . 7 A . 3 . 8 A . 3 . 9 A. 4 一次性无菌有盖塑料细胞培养瓶( 2 5 c m ) . 二氧化碳恒温培养箱， 3 7 恒温培养箱( 内置细胞瓶旋动培养装置) 。 一次性微孔滤膜滤菌器。 负压抽滤瓶及电动真空泵。 电渗析一 离子交换纯水器、 石英玻

11、璃重( 双) 蒸馏器。 普通冰箱( o 0 C 一2 0 0C) , 电热干烤箱、 高压蒸汽灭菌器。 1 0 K L -1 0 0 p L , 1 0 0 f- L - 1 0 0 0 p L 可调式微量 加样器及塑料尖吸头。 玻璃吸管、 量筒、 三角烧瓶。 血清学试验用主要器材 A . 4 . 1 9 6 孔微量滴定板。 A . 4 . 2 2 5 1 L , 5 0 t L , 1 0 0 t L 定量加样器及塑料尖吸头。 A . 4 . 3 微型混合器、 涡旋振荡器。 A . 4 . 4 3 7 及 5 6 水浴箱。 A . 4 . 5 电动离心机( 4 0 0 0 r / mi n )

12、 . A . 4 . 6 普通冰箱。 A . 4 . 7 酶标检测仪、 洗板机。 A . 4 . 8 低温( -2 0 0C) 冷冻切片机。 A . 4 . 9 镀膜多孔( 8 孔1 0孔) 载玻片( 制备抗原片用) 等。 A . 5 动物实验用器材 目前细胞培养法虽已成功地取代动物接种， 应用于埃博拉病毒的分离与鉴定。但仍须准备对留验 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 的可疑染病或死亡动物进行采血、 解剖取材送检。所需的常用器材包括: 一次性无菌的5 m L -1 0 mL注射器和针头; 无菌的动物解剖用器械， 动物解剖台; 盛有E D T A抗凝剂的有塞无菌试管、 无菌的组织

13、容器及低温( C O : 干冰) 冷藏送检装置; 病兽留验隔离观察的饲养笼具， 专用的病死动物尸体焚化炉. S N / T 1 4 3 9 -2 0 0 4 附录B ( 资料性附录) 常用溶液及配制 B1 细胞培养常用溶液 B . 1 . 1 基础营养液 E a g l e 最低需要培养液( 简称E M E M) , G i b c o 公司生产， 按产品说明书称取一定量干燥试剂用新 鲜双蒸馏水配制。过滤除菌， 小瓶分装， 4 C贮存备用。 B . 1 . 2 完全培养液 根据需要取 E ME M基础营养液再添加5 %-1 0 %胎牛血清( F C S ) 或新生小牛血清( N C S ) ,

14、( 注: 细 胞营养维持液只需加人 2 % F C S或 N C S ) 。青霉素 1 0 0 I U / mL ， 链霉素 1 0 0 p g / mL及庆大霉素 5 0 y g / m L ; 并用5 %碳酸氢钠调节至p H 7 . 2 -p H 7 . 4 , B . 1 . 3小牛血清 无菌的优质新鲜胎牛血清或新生小牛血清， 不含有支原体及其他细胞毒性物质， 分装灭后活备用。 B . 1 . 4 Ha n k s 平衡盐溶液( 简称 H B S S ) B . 1 . 4 . 1 Ha n k s液( 2 0X) : 母液甲( 2 0 X) 成分 Na C l 1 6 0 g , K

15、C I 8 . 0 g , Mg S O , 7 H, 0 2 . 0 g , Mg C I , 6 H 2 0 2 . 0 g C a C 1 2 2 . 8 g 母液乙( 2 0 X) 成分 Na z HP q 1 2 H , O 3 . 0 4 g , K H P 认 1 . 2 0 g , 葡萄糖 2 0 . 0 0 g 2 g / L的酚红溶液 1 0 0 mL 配法: 首先将母液甲各成分逐一溶解于8 0 0 mL去离子水中， 将C a C I : 单独溶解于 5 0 mL去离 子水后缓慢加人混匀， 用水补充至 1 0 0 0 m L ; 将母液乙各成分溶解于 8 0 0 mL去离子

16、水， 再加人酚红 溶液， 混匀后用去离子水补充至 1 0 0 0 mL; 并在两液中各加三抓甲烷 2 m L作为防腐剂， 塞好瓶塞， 置 4 冰箱保存。 B. 1 . 4 . 2 Ha n k s应用液( l x) 配法: 取母液甲和母液乙各一份， 加人去离子水 1 8份， 分装后塞好瓶塞， 1 1 5 高压蒸汽灭菌 1 5 m i n ， 置室温或4 冰箱保 存， 可使用一个月。 临 用时 用5 纬 N a H C O , 调至所需的p H值。 B . 1 . 5 抗生素贮存液 用无菌注射用水或 Ha n k s 液配制每毫升内含青霉素 1 0 0 0 0 I U, 链霉素 1 0 0 0

17、0 la g及庆大霉素 5 0 0 0 p g 的抗生素贮存液。分装小瓶( 2 mL / 瓶) ， 一2 0 冷冻保存。使用时按 1 %量加人完全培养 液内。 B . 1 . 6 细胞消化液 成分: 胰酶0 . 2 5 g , Ha n k s 液 1 0 0 m L， 抗生素贮存液 I mL 配法: 将胰蛋白酶溶解于 H a n k s 液， 加人抗生素， 过滤除菌， 分装小瓶， -2 0 冷冻保存。每次按需 用量取用， 不能反复冻融。 B . 2 血清学试验用溶液和试荆 B . 2 . 1 硼酸盐缓冲液( p H 9 . 0 , 0 . 0 5 m o l / L ) 母液甲( 0 . 5

18、 m o l/ L N a C l 液) , N a C l 8 7 . 6 8 g ， 去 离子水 加至1 0 0 0 m L . s S N/ T 1 4 3 9 - 2 0 0 4 母液乙( 0 . 5 mo l / L硼酸) ; H, B 认 3 0 . 9 2 g ， 去离子水加至 1 0 0 0 m L . 母液丙( 1 m o l / L N a OH溶液) , N a OH 4 0 g ， 去离子水加至 1 0 0 0 mL . 配制法: 取母液甲8 0 mL ， 母液乙 1 0 0 mL ， 母液丙2 4 mL， 去离子水加至 1 0 0 0 mL . B . 2 . 2 磷

19、酸盐缓冲盐水( p H 7 . 4 , 0 . 0 1 m o l / L ， 简称P B S ) 称取Na z H P O , 1 2 Hz 0 2 . 9 g , N a H, P O , “ 2 H2 0 0 . 3 g ， 及 Na C l 8 . 5 g ， 用去离子水溶解至 1 0 0 0 mL .高压蒸汽 1 1 5 灭菌 1 5 m i n -2 0 mi n 后备用。 B . 2 . 3洗液( P B S - T, E LI S A试验用) 0 . 0 1 m o l / L , p H 7 . 4 P B S 内含0 . 0 5 写 吐温- 2 0 . B . 2 . 4

20、封闭液 B . 2 . 4 . 1 供E L I S A试验用 称取去脂奶粉( B a c t o s k i m m i l k , D i f c o ) 5 g溶于 1 0 0 mL P B S - T. B . 2 . 4 . 2 供免疫印迹试验( I B T ) 用 P B S内含有5 %去脂奶粉， 0 . 0 5 %牛血清白蛋白( B S A) , 0 . 5 %吐温- 2 0 和 。0 2 环Na N , . B . 2 . 5 底物液 B . 2 . 5 . 1 H2 0 2 - A B T S ( 供以 H R P为标记酶的 E L I S A试验用) 称取 2 , 2 一

21、连氮一 双( 3 一 乙基苯并唾哇琳) 磺酸钱盐( A B T S ) 3 . 0 mg ， 溶解于 1 0 mL拘椽酸一 磷酸盐缓 冲液( 0 . 1 mo l / L构椽酸和0 . 2 m o l / L Na t HP O 、 等量混合) 1 1临 用前加人 3 0 o H 2 O z 1 0 k L 。反应终止液 为1 . 2 5 0 o N . F . B . 2 . 5 . 2 H, q- 4 - 氯- 1 - 蔡酚( 供以 H RP为标记酶的I B T试验用) 4 - 氯- 1 - 蔡酚( 3 m g / mL ) 水溶液3 . 0 ML +9 . 0 mL P B S混合后，

22、加人 1 % H Z O Z 1 5 0 1+ L ， 立即使用。 此底物液应在临用前新鲜配制。着色区带呈紫色。 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 附录C ( 规范性 附录) 检验方法 C ， 1电镜法 C . 1 . 1 采集急性发热期病人抗凝血、 尿样为标本( 按常规方法处理) 。 C . 1 . 2 经。 . 5 %甲醛固定， 低速离心去沉渣， 再以2 5 0 0 0 g 离心6 0 m i n沉淀病毒毒粒， 重悬浮毒粒至 原标本体积的 1 / 1 0 0 , C . 1 . 3 用 1 %的磷钨酸盐负染后电镜检测。 C . 1 . 4 以检出丝状病毒颗粒为感染阳性结果。

23、C . 2 抗原检测 C . 2 . 1 抗体包被微孔板 用杭埃博拉病毒的鼠单克隆抗体( 腹水型) 混合物作为捕获抗体包被微孔板。先经棋盘滴定法确定 抗体的最适稀释度， 用 0 . 0 1 mo l / L , p H7 . 4 P B S稀释的抗体1 0 0 p L包被微孔板， 放 4 过夜。同时以 相同稀释度用骨髓瘤细胞诱生的小鼠腹水包被微孔板作为对照。 C . 2 . 2 弃去包被液 用P B S - T洗涤微孔板三次; 再加入封闭液( 含 5 %去脂奶粉的 P B S - T ) 2 0 0 p L / 孔， 3 7 作用 1 h ， 弃 去封闭液; 用 P B S - T洗一次。 C

24、Z 卜 3 样品检测 将待检血清或组织匀浆( 1 0 环) 以含 5 %去脂奶粉的P B S - T， 做I， 4 , 1， 1 6 , 1 : 6 4 , 1， 2 5 6稀释， 各 取1 0 0 川 加人 抗体包被孔和对照孔内。 3 7 0C 温育1 h 后， 弃去样品， 用P B S - T洗涤三次。 加人经过滴 定适当稀释的兔抗埃博拉病毒免疫血清( 1 0 0 I L / 孔) 作为检测抗体， 再于 3 7 0 C 温育 1h ， 用 P B S - T洗涤 三次。然后加人辣根过氧化物酶( H R P ) 标记的羊抗兔抗体， 3 7 温育 1 h ， 用 P B S - T洗涤三次。最

25、后加 入H z 姚/ A B T S 底物液( 1 0 0 P L / 孔) ， 室温 避光作用3 0 m i n , 在4 1 0 n m波长检测各 孔的 吸光度( A值) 。 每次实验均需同时用 5份6 份正常人血清作为阴性对照。 C . 2 . 4 结果判定 以阴 性对照血清组A值的均值十3 S D ， 为临界值( c u t o f f ) ， 检品 孔的A值大于等于临界值为阳 性， 反之为阴性。检品 1: 1 6 以上呈阳性反应， 或经过校正的A值( 抗体包被孔 A值一对照孔 A值) 大于 0 . 4 5 , 判定为埃博拉病毒抗原检测阳性。 C . 3 病毒分离 C . 3 . 1

26、急性期病人血清用P B S I: 1 0 稀释 C . 3 . 2 取 1 0 0 k L稀释的血清接种一瓶( 2 5 c m ) 长满单层的 V e r o E 6 细胞。 C . 3 . 3 在 3 7 旋摇感染 1h加人7 mL E a g l e ME M培养液( 含2 %灭活的胎牛血清， 1 0 0 I U / mL青霉 素， 1 0 0 p g / m l , 链霉素和5 0 I g / m 工 一 庆大霉素) ， 旋紧瓶盖， 置于 3 7 0 C 培养。每天观察一次细胞病变 ( C PE ) 情况 C . 3 . 4 培养第7d换液一次， 如 C P E细胞低于5 0 写， 继续

27、培养至1 4 d收获细胞， 制片， 应用间接免疫 荧光试验( I F A) 进行鉴定。用抗埃博拉病毒单克隆抗体或 1， 6 4稀释的恢复期病人血清为检定抗体， 1 ) S D为5份 - 6 份正常人血清 A值标准差 S N / T 1 4 3 9 -2 0 0 4 再以 F I T C标记的羊( 或兔) 抗鼠( 或抗人) 抗抗体结合后， 在荧光显微镜下检查( 见C . 5 . 3 ) . C . 4 反转录聚合酶链反应( R T - P C R ) C . 4 . 、 样品R N A的提取 使用商品 试剂盒( R N A i d K i t ; B i o 1 O 1 , L a J o l

28、la , C A ) z 。 从染疫者全血、 血 清、 组织匀浆及钻膜分泌 物样品中 提取R N A 。立即用于R T - P C R或置一7 0 低温 保存。 操作步 骤按试剂盒使用说明书进行。 C. 4 . 2 c DNA转录反应 使用G e n e A m p ( P e r k i n - E l m e r , N o r w a l k , C T ) R N A - P C R试剂盒， ， 。 取5 p L 提取的R N A与2 . 5 p L E B O - G P I 引物 5 - A A T G G G C T G A A A A T T G C T A C A A T C

29、 ( +) , 1 0 0 n g 加L 在 E P管内混合， “加热 1 mi n ， 置乙醇一 干冰浴内快速冷冻， 然后在室温解融; 加人 。 . 5 p L R N A酶抑制因子， 3 p L 5 x R T 缓冲 液， 3 p L 5 m m o l / L d N T P 和 1 p L鼠白血病病毒逆转录酶; 涡旋混匀后短暂离心; 放置 4 2 C, 3 0 min以上 C . 4 . 3 E B O V - G P墓因扩增 在上述反应管内加人 8 . 5 p L l O x P C R缓冲液， 8 p L 2 5 m m o l / L氯化镁( Mg C h ) , 8 p L 2

30、 . 5 m m o l/ L d N T P , 3 p L E B O - G P 1引物 5 - A A T G G G C T G A A A A T T G C T A C A A T C ( +) , 1 0 0 n g / p L 和 3 p L E B O - G P 2引物 5 - T T T T T T T AG T T T C C C A G A A GG C C C A C T( 一) ， 1 0 0 n g / p L , 5 4 p L纯水及 0 . 5 I L T a q D N A聚合酶( 总量为 1 0 0 p L ) 。9 4 变性3 0 s , 3 7 0

31、C 退火 3 0 s , 7 2 延伸2 mi n ， 进行3 个循 环; 再于 9 4 变性 3 0 s , 4 5 退火 3 0 s , 7 2 延伸1 mi n ， 进行 3 0个循环; 最后冷却至 C C. C . 4 . 4 扩增产物检测 用1 . 5 %琼脂糖凝胶电泳， 澳化乙锭( E B ) 染色， 紫外线透射鉴定。特异性靶基因( E B OV - G P ) 扩增 条带的长 度为5 8 0 b p , C . 5 杭体检测 C . 5 . 1 特异性I g G抗体检测-E L I S A间接法 C . 5 . 1 . 1 病毒抗原的制备 用旋转培养法培养 MA1 0 4细胞至长

32、满单层， 接种埃博拉病毒， 当绝大多数细胞出现病变后， 用橡 胶刮棒刮落细胞; 将细胞悬液在4 C , 1 0 0 0 0 g离心 1 0 min ， 细胞沉淀用 。0 1 mo l / L , p H 9 . 0硼酸盐缓 冲液洗涤一次， 再同上离心沉淀。 细胞用含1 % T r i t o n X - 1 0 0 的硼酸盐缓冲液( p H 9 . 0 ) 悬浮， 经超声波 ( 5 0 % d u t y c y c le ) 处理1 0 m i n ， 在4 0C , 1 0 0 0 0 g 离心1 0 m in ， 上清经7 - 射线照 射( 5 X 1 0 6 r a d ) 灭活病毒，

33、 去除感染性。存放一2 0 备用。使用正常MA 1 0 4 细胞培养物同上法制备抗原对照。 C . 5 . 1 . 2 抗原包被微孔板 使用参比 血清进 行棋盘滴定确定包被抗原量。将1 0 0 p L 0 . 0 1 m o l / L , p H 7 . 4 P B S 稀释的抗原包 被微孔板， 在4 过夜; 同时用正常 MA 1 0 4 细胞抗原包被微孔板作为对照。 C . 5 . 1 . 3 血清检测 用P B S - T洗三次去除未吸附抗原， 加人 1 0 0 K L稀释( 用含 5 %去脂奶粉的P B S - T) 的被检血清( 可 做4 倍稀释 1 ， 4 , 1 ， 1 6 ,

34、1 ， 6 4 , 1， 2 5 6 ， 进行半定量检测) ， 在3 7 0 C 结合 3 0 m i n 。同上洗三次. 加人辣根 过氧化物酶( HR P ) 标记的鼠抗人 坛G抗体， 3 7 0C结合 3 0 mi n ， 同上洗三次; 然后加人底物液 H z O z - A B T S ， 室温避光作用 3 0 min ， 在 4 1 0 n m波长检测各孔的吸光度( A值) 。每次测定均需使用 S份6 份正常人血清做阴性对照。 C . 5 . 1 . 4 结果判定 以正常血清对照组A值的均值+3 S D作为临界值( c u t o f f ) ， 检品孔 A值高于临界值者判为阳性， 反

35、 2 ) , 3 ) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对这一( 或这些) 产品的认可. S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 之为阴性。 C . 5 . 2 特异性 I g m捕获 E L I S A ( MA C - E L I S A ) C . 5 . 2 . 1 病毒抗原的制备 同 C . 5 . 1 . 1 。 C . 5 . 2 . 2 抗体包被微孔板 用1 0 0 E a L 适当 稀释的 特异性羊抗人k 链抗体包被微孔板( 羊抗人W 链抗体包被及 病毒 抗原结合量 均按照棋盘滴定法确定) , 4 过夜。 C . 5 . 2 . 3 血清检测 弃去包被液

36、， 用P B S - T洗涤三次， 分别加人1 0 0 p L 1 ， 2 0 , 1 ， 4 0 , 1 ， 8 0 及1 ， 1 6 0 稀释的被检血 清， 在3 7 结合 3 0 m i n 。同上洗三次， 加人 1 0 0 k L埃博拉病毒抗原， 3 7 结合 3 0 mi n ， 同上洗三次; 加 人鼠 抗埃博拉病毒的 单克隆混 合抗体， 3 7 结合3 0 m i n ， 同上洗 三次; 再加人1 0 0 u L 羊( 或兔) 抗鼠I g G 重链和轻链特异性的辣根过氧化物酶标记物， 在3 7 0 C 结合3 0 mi n ; 底物液使用 Hz 02 - A B T S ， 在4

37、1 0 mm 波长检测各孔的吸光度( A值) 。每次均需使用5 份6 份正常人混合血清作对照。 C . 5 . 2 . 4 结果判定 以正常血清对照组 A值的均值+3 S D作为临界值( c u t o f f ) . 检品孔A值高于临界值者判为阳性， 反之为阴性。 C . 5 . 3间接免疫荧光试验 ( I F A) C . 5 . 3 . 1 抗原片制备 埃博拉病毒感染V e r o E 6 细 胞7 d ， 用玻璃珠或橡胶刮 棒悬浮细胞， 悬浮液1 7 5 0 g 离心1 5 m i n ， 弃 上清， 用 P B S洗三次， 加入适量正常 V e r o E 6细胞， 用 Y - 射线

38、照射( 5 X1 0 6 r a d ) 灭活病毒。将适当稀释 的细胞滴于8 孔一1 0 孔镀膜玻片( 4 0 u L / 孔) 制作抗原片， 在负压超净台内晾干后， 用一2 0 冷丙酮固 定， 晾干后密闭于放有干燥剂的容器内， 置于一7 0 保存 C . 5 . 3 . 2血清检测 将被检血清用 P B S 做 1 : 4 , 1 : 1 6 , 1 : 6 4 , 1 : 2 5 6 稀释， 分别滴加于抗原片上， 放湿盒内置 3 7 0C 3 0 mi n , P B S洗三次， 加人F I T C标记的羊抗人 I g G抗体( 含0 . 0 5 纬伊文思蓝) , 3 7 0C 3 0 m

39、i n ， 再洗 三次， 风干， 用5 0 %甘油( P B S配制) 封片， 在荧光显微镜下观察。 C . 5 . 3 . 3 结果判定 细胞膜和胞浆内呈显特异性翠绿色荧光者为阳性， 暗红色为阴性。以血清 1， 6 4稀释以上为抗体 检测 阳性 。 C . 5 . 4 免疫印迹试验UB T ) C . 5 . 4 . 1 病毒抗原的制备 用埃博拉病毒株以。 . 1 P F U/ c e l l 量接种 V e r o E 6 细胞， 7d 后用玻璃珠或刮棒悬浮细胞， 悬浮液以 1 7 5 0 g 离心1 5 m i n ， 上清液经4 0C, 2 5 0 0 0 g 离心1 2 0 m i

40、n ; 沉淀的病毒用相当于原细胞培养上清液 1 / 1 0 0 体积的T N E ( T r i s - N a C t- E D T A ) 缓冲 液悬浮后， 仔细加至2 0 0 0 7 0 %蔗糖梯度液上层， 1 7 5 0 0 g ( S p i n c o S W 4 0 ) 离心1 8 h ， 收集病毒层， 用T H E 缓冲液稀 释， 再以2 5 0 0 0 g 离心3 0 m i n ， 收 集病毒沉淀 物冻存于一7 0 备用。 C . 5 . 4 . 2 S D S - 聚丙烯酸胺凝胶电泳( S D S - P A G E ) 对病毒采用 1 0%NP - 4 0 ( 0 .

41、0 5 mo t / L N a C 1 配制) 处理 1 5 mi n 。用 1 0 % -1 5 % S D S P A GE梯度胶电 泳， 上样量为: 8 0 m m X0 . 7 5 m m槽面积( 可截成 2 0条) 载样 1 0 0 Ji g ， 电泳后， 凝胶用银染色观察， 可见 7 条病毒蛋白带: 2 0 0 k D a大蛋白( L ) , 1 2 0 k D a 糖蛋白( GP ) , 1 0 5 k D a 核蛋白( NP ) , 以及其他 4种未确 定功能蛋白V P 4 0 , V P 3 5 , V P 3 0 , VP 2 4 , C . 5 . 4 . 3 电转膜

42、S D S - P A GE申泳后， 将凝胶上抗原经电泳转移到 0 . 4 5 k m孔径的硝酸纤维素膜上， 用封闭液( 5 % S N / T 1 4 3 9 -2 0 0 4 去脂奶粉、 0 . 0 2 %登氮 钠, 0 . 0 5 %B S A和0 . 5 %吐温 - 2 0 , P B S 配制) 4 封膜过夜。次日 用P B S - T洗膜 三次， 切成 2 0 膜条( 4 mm/ 条) ， 作为抗体检测用抗原膜条. C . 5 . 4 . 4 血清检测 被检血清用含5 %去脂奶粉的P B S T稀释成 1， 1 0 0 ， 于 3 7 与膜条结合 4 h , 洗三次， 再与羊抗人

43、I g GH R P 酶标记物于3 7 结 合1 h ， 洗三次， 用H 2 0 2 - 4 - 氯 - 1 - 禁酚为底物显色。 C . 5 . 4 . 5 结果判定 同 时出现N P 和V P 3 0 或N P 和V P 2 4 显色区 带( 呈紫色) 的血清标本可确认为埃博拉病毒抗体 阳性 。 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 附录D ( 规范性附录) 实验室生物安全及 防护措施 D . 1 实验室生物安全 D . 1 . 1 在生物安全四级( P 4 ) 实验室中进行的操作 下列操作应在生物安全四级( P 4 ) 实验室中进行。在设施的工作区内， 所有的工作都要限制在皿级

44、 生物安全柜或 Q 级生物安全柜与一套生命维持系统供气的正压防护服联合使用: 用细胞培养的方法分离病毒; 收集或浓缩病毒或其培养产物; 用活病毒或病毒的全基因接种动物。 D _ 1 . 2 在生物安全三级( P 3 ) 实验室中进行的操作 下列操作应在生物安全三级( P 3 ) 实验室: 血清和血液、 其他体液、 排泄物等样品的诊断检测; 溶解、 固定或其他方法处理灭活的病毒和( 或) 无传染性的病毒基因片段; 可能产生气溶胶 的样 品处 理; 临床样品的包装、 分装; 离心管和离心机转头的封闭和开启。 D . 2防护措施 D . 2 . 1 操作的人员应具备的防护措施 D , 2 . 1 .

45、 1 佩带N9 5级口罩， 按照操作者鼻部尺寸调整口罩的鼻金属夹， 保证做到呼出和吸人的气体确 实经过口罩过滤 D . 2 . 1 . 2 佩带可以遮盖脸部的防护面罩或防护眼罩。 D . 2 . 1 . 3 佩带外科手术帽， 并遮盖住双侧耳部。 D . 2 . 1 . 4 佩带两层外科手术乳胶手套。每完成一次可能接触含有病原的样品的操作后， 应更换外层 手套， 再进行下一步操作。 D . 2 . 1 . 5 穿着实验白大衣， 在白大衣外再穿着外科手术衣或连体隔离服( 最好为防水材料) ， 双上肢佩 带袖套， 并用乳胶手套袖端将袖口覆盖、 绷紧; 双下肢穿着裤套， 并用鞋套上部橡皮筋将裤套下段绷

46、紧。 D . 2 . 2 操作场地与实验材料的消毒处理 D . 2 . 2 . 1 从班级生物安全柜或P 4 实验室拿出的活的或完整无损的生物材料， 首先要装到一个打不破 的一级容器里然后密封在一个打不破的二级容器里， 最后通过消毒浸泡容器、 熏蒸消毒柜( 烟熏消毒舱) 或专用的气锁口将该双层容器拿出实验室。 D . 2 . 2 . 2 除活的或完整无损的生物材料外， 其他材料在离开实验室之前必须高压灭菌或消毒， 否则任 何材料不能拿出实验室。可能被高温或蒸汽破坏的器材或材料可装在专门的气锁或消毒柜里用气体或 烟雾剂消毒。 D . 2 . 2 . 3 所有拿出实验室的材料应经过双门高压灭菌器消

47、毒.该实验室的高压灭菌器骑墙部分与外 墙之间的缝隙是密封的， 高压灭菌器的双门是自动控制的， 以保证只有在高压“ 灭菌” 已完成后向外的门 才能打开。 D . 2 . 2 . 4 通过浸泡容器、 熏蒸消毒柜或相应的消毒方法， 那些不能高压灭菌的材料和器材才能安全地 拿出实验室。 1 2 S N/ T 1 4 3 9 -2 0 0 4 D . 2 . 2 . 5 在完成有感染性材料的工作后， 特别是有明显的溢出、 溅出或被其他感染性材料污染后， 按 常规对实验室器材进行消毒。污染器材在送出修理或维护之前要消毒。 D . 2 . 2 . 6 感染性材料一旦溢出， 要由相应的专职人员或其他经过培训并

48、配备有浓缩的 感染性材料消 毒设备的人员进行消毒、 防护和清扫。 D . 2 . 2 . 7 从皿级生物安全柜里进行工作的实验室的一般房间排出的气体， 在排除前要通过高效粒子 空气过滤器处理。排除的气体包括来自实验室占据的空间和进人气体。皿级生物安全柜排除的气体在 排出之前， 要通过两个串联的高效粒子空气过滤器处理。对来 自在工作人员穿正压服的实验室里的n 级生物安全柜处理过的排出气体， 可以排到人动物房环境或通过实验排气系统排出。 D . 2 . 3 报告监督系统 D . 2 . 3 . 1 建立实验室事故、 暴露、 人员缺席或可能与实验室感染相关的疾病的医学监督报告系统， 整 理和保存记录。 D . 2 . 3 . 2 建立观察室， 以备对实验室相关疾病的工作人员进行检疫、 隔离、 医学观察和治疗之用。