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1、论著 S y n d e c a n - 1在神经干细胞的表达及其 与A C 1 3 3的关系 孙万平 薛 群 张 稷 曲 静 张学光 【 摘要】 目的 研究s y n d e c a n - 1(C D 1 3 8)在人的胚胎神经干细胞上的表达及其与A C 1 3 3的关 系。方法 采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析, 通过C D 1 3 8、A C 1 3 3直标单克隆抗体(mA b) 观察 神经干细胞细胞膜上C D 1 3 8和A C 1 3 3荧光标记阳性率; 同时通过双重免疫荧光标记法, 观察神经干 细胞细胞膜上共表达C D 1 3 8和A C 1 3 3的百分比。结果 神经干细胞上均
2、表达C D 1 3 8和A C 1 3 3分 子, 同时, 表达A C 1 3 3分子的神经干细胞约有5 0%左右表达C D 1 3 8分子。结论 在神经干细胞的早 期已有C D 1 3 8分子的表达, 其对神经干细胞的生长、 分化等作用值得进一步研究。 【 关键词】 S y n d e c a n - 1(C D 1 3 8) ;A C 1 3 3;单克隆抗体 T h ee x p r e s s i o no f s y n d e c a n - 1(C D 1 3 8)o ne m b r y on e r v es t e mc e l l sa n dt h er e l a t
3、i o n s h i pb e t w e e nC D 1 3 8 a n dA C 1 3 3 D + , 9 7 E / 650N 4GQ A C 1 3 3;M o n o c l o n a l a n t i b o d y . 江苏省干 细胞重点实验室( 薛 群、 张 稷、 曲 静、 张学光) S y n d e c a n - 1(C D 1 3 8) 存在于多种干细胞的表面, 可作为人胚胎脑组织干细胞表型的一个重要标记 1; 同时,A C 1 3 3分子只在干细胞早期阶段表达, 当干细 胞处于祖细胞和前体细胞阶段时A C 1 3 3消失。因 此, 以A C 1 3 3作为参
4、照标记, 观察C D 1 3 8在神经干细 胞上的早期是否表达对研究C D 1 3 8是否参与神经干 细胞的早期生长、 增殖、 分化是很有必要的。 资料与方法 一、 生物试剂 DMEM/F 1 2(H y c l o n e) ,b F G F(S i g m a) ,E G F ( S i g m a) ,B 2 7(G i b c o) ,F I T C标 记 的C D 1 3 8 mA b ( S i g m a) ,P E标记的A C 1 3 3 mA b(S i g m a) 。 二、 神经干细胞的分离及扩增 本研究中人胚胎神经干细胞的使用严格遵守医 学伦理道德并得到医院许可。在严格
5、无菌条件下取 胎龄为1 0周流产的人胚, 7 0%酒精浸泡5m i n, 放入 无菌的平皿, 超净台内操作。去掉皮肤与头骨, 仔细 分离剪下大脑皮层, 放入加有抗生素的P B S液中冲 洗3次, 吸管反复吹打机械分离制成单细胞悬液, 显 微镜下计数后于每培养瓶( 7 5m l规格) 中加入8 1 0 5 个细胞, 使用DMEM/F 1 2( 1:1) 加B 2 7( 每1 0 0 m l培养液中加入2m lB 2 7) 的无血清培养基, 同时 加入b F G F、 E G F( 浓度均为2 0n g/m l) ,放入3 7, 5% C O2培养箱,每3天换液一次。待原代克隆形 成后再次吸管吹打
6、机械分离制成单细胞悬液, 每培 养瓶中加入51 0 5 个细胞。此后每57天机械分 离克隆传代一次, 方法同前。 三、 神经干细胞的传代培养 培养71 0d, 根据细胞的生长情况和密度, 吸 除一半培养基, 用吸管反复吹打细胞团, 尽量使其分 散, 细胞计数后放入2 5c m 2 培养瓶中继续培养。 四、 流式细胞仪分析 用机械法离散培养第2代神经干细胞球后, 将 离散神经干细胞分于流式管中( 51 0 5/管) , 用P B S 洗涤, 分别将P E标记的A C 1 3 3和F I T C标记的 9 江苏医药2 0 0 6年1月第3 2卷第1期 J i a n g s uM e dJ,J a
7、 n u a r y2 0 0 6,V o l 3 2,N o . 1 C D 1 3 8直标单抗加入待测的神经干细胞样本中孵 育4 5m i n, P B S洗涤两遍后用于流式细胞仪分析。 五、 双重免疫荧光标记法 用机械法离散培养第4代的神经干细胞球后, 取神经干细胞于流式管中, 同时将标记的A C 1 3 3和 C D 1 3 8直标单抗加入待测的神经干细胞样本中孵 育4 5m i n, P B S洗涤两遍后用于流式细胞仪分析。 结果 一、 神经干细胞分离、 扩增、 传代 培养2 4h后悬浮着的单个细胞开始三三两两 聚集成为小团块, 再逐渐聚集成为大团块, 形状不规 则, 边缘毛糙, 厚
8、薄不均。随着培养时间的延长, 悬 浮生长的团块越来越大, 形状开始变得规则, 边缘光 滑, 厚薄相当。每个团块中有数百至上千个细胞。 首次传代需71 0d, 传代后细胞重复上一代的生长 过程, 团块形状逐渐规则, 呈球状悬浮生长( 见插页 2图1) 。 以后每7天传代一次, 在培养的过程中, 培养物 中的非神经干细胞会逐渐发生贴壁或不贴壁, 并随 着传代次数的增多遭到清除, 从而使得培养中成团 的神经干细胞得到纯化。 二、 流式细胞仪测定结果 第2代A C 1 3 3表达的阳性率为1 2 . 2%, C D 1 3 8 表达的阳性率为8 . 7%( 见插页2图2、 3) 。取第4 代的神经干细
9、胞球进行双重免疫荧光标记测定时, A C 1 3 3表达的阳性率为1 2 . 0%,C D 1 3 8表达的阳性 率为9 . 4%,C D 1 3 8和A C 1 3 3双标的散点图显示, A C 1 3 3阳性的神经干细胞 中 约 有5 0%左 右 表 达 C D 1 3 8分子( 见插页2图4) 。 讨论 引产胚胎脑皮层的细胞在制成单细胞悬液后, 在培养液中培养2 4小时后就可见悬浮着的单个细 胞开始三三两两聚集成为小团块, 随后逐渐聚集成 为大团块并呈球状悬浮生长, 表明细胞能不断地进 行增殖。在神经干细胞的生长分化过程中,C D 1 3 8 的表达也发生变化。由于C D 1 3 8分子
10、只在干细胞 早期阶段表达, 当干细胞处于祖细胞和前体细胞阶 段时C D 1 3 8消失。本研究中, 应用流式细胞仪分析 对球状悬浮生长的细胞表型测定, 其表达A C 1 3 3的 阳性率为1 2 . 2%, 结合取自胚胎脑皮层的培养细胞 不断增殖的特性, 表明了神经球中含有神经干细胞。 本研究采用第2代的神经干细胞球测定P E标 记的A C 1 3 3和F I T C标记的C D 1 3 8表达, 其中的 A C 1 3 3阳 性 细 胞 为1 2. 2%,C D 1 3 8阳 性 细 胞 为 8 . 7%。 取第4代的神经干细胞球进行双重免疫荧光 标记 测 定 时,A C 1 3 3表 达
11、的 阳 性 率 为1 2 . 0%, C D 1 3 8表达的阳性率为9 . 4%。第2代和第4代的 C D 1 3 8和A C 1 3 3表达的阳性率基本一致, 说明本研 究使用的培养基可基本保持培养的神经干细胞处于 未分化状态, 同时也说明进行双重免疫荧光标记测 定时, C D 1 3 8和A C 1 3 3之间不会出现相互干扰, 从 而影响实验结果。 C D 1 3 8属于粘附分子整合素跨膜粘结蛋白聚 糖家族成员, 通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结 合一系列配基如细胞粘附分子、 基质成分、 生长因 子、 酶和酶抑制物等, 以共受体方式调节细胞与微环 境之间的相互作用, 参与组织器官分化发
12、育、 血管形 成、 组织再生等一系列生理过程的调节 1。对于 C D 1 3 8的研究目前主要集中在其对肿瘤细胞的生 长、 分化方面。目前,C D 1 3 8已作为肿瘤细胞分化 和预后的一个重要分子 24, A C 1 3 3分子只在干细 胞早期阶段表达, 当干细胞处于祖细胞和前体细胞 阶段时A C 1 3 3消失。本实验以C D 1 3 8作为参照标 记, 可观察C D 1 3 8在神经干细胞上的早期是否表 达, 是否可在A C 1 3 3表达时就能表达C D 1 3 8。结果 显示,A C 1 3 3阳性的神经干细胞中约有5 0%左右共 表达C D 1 3 8分子, 由此可见,C D 1
13、3 8在人胚胎脑组 织干细胞早期阶段就有一定量的表达, 即在干细胞 处于祖细胞和前体细胞阶段前就已表达C D 1 3 8。 本研究可为进一步研究神经干 细 胞 早 期 表 达 的 C D 1 3 8分子对早期神经干细胞的生长、 分化等功能 作用提供实验依据。 参考文献 1 F i l l aM S,D a mP,R a p r a e g e rA C.T h ec e l l s u r f a c ep r o t e o g l y c a n s y n d e c a n - 1m e d i a t e s f i b r o b l a s t g r o w t h f a c
14、 t o r - 2b i n d i n ga n da c t i v - i t y . JC e l lP h y s o l,1 9 9 8,1 7 4:3 1 0 - 3 2 1. 2 A n t o n e nA,K a j a n t iM,H e i k k i l aP,e t a l . S y d e c a n - 1e x p r e s s i o n h a sp r o g n o s t i cs i g n i f i c a n c ei nh e a da n dn e c kc a r c i n o m a .B rJ C a n c e r,1
15、9 9 9,8 9:5 5 8 - 5 6 4. 3 D o b r aK,N u r m i n e n M,H j e r p eA.G r o w t hf a c t o r sr e g u l a t et h e e x p r e s s i o np r o f i l eo f t h e i r s y n d e c a nc o - r e c e p t o r s a n d t h ed i f f e r e n - t i a t i o no f m e s o t h e l i o m ac e l l s . A n t i c a n c e r
16、R e s e a r c h,2 0 0 3,2 3: 2 4 3 5 - 2 4 4 4. 4 B a y e r - G a r n e r I B,S a n d e r s o nR D,S m o l l e rB R. S y d e c a n - 1e x p r e s - s i o ni sd i m i n i s h e d i na c a n t h o l y t i c c a u t a n e o u s s q u a m o u s c e l l c a r c i - n o m a . JC u t a nP a t h o l,1 9 9 9,2 6:3 8 6 - 3 9 0. ( 收稿日期:2 0 0 4 - 1 1 - 2 2)( 供稿编辑: 王 瑶) 01 江苏医药2 0 0 6年1月第3 2卷第1期 J i a n g s uM e dJ,J a n u a r y2 0 0 6,V o l 3 2,N o . 1