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1、第 24 卷 第 3 期 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 Vol.24, No.3 2006 年 6 月 J. Radiat. Res. Radiat. Process. June 2006 苏州大学医学发展基金重点项目(EE126031)、江苏省放射医学重中之重学科（FY2004）资助 第一作者：宁萍，女，1973 年 4 月出生，1997 年毕业于苏州医学院药学系，硕士，从事放射生物学研究，实验师 通讯联系人：刘芬菊 收稿日期：初稿 2005-12-21，修回 2006-02-24 Tamoxifen 联合 线照射对脑胶质瘤细胞的增殖抑制 及凋亡诱导作用 宁 萍 1,2 刘芬菊
2、1,2 薛 景 1 1（苏州大学放射医学与公共卫生学院 江苏苏州 215123） 2（江苏省放射医学与防护重点实验室 江苏苏州 215123） 摘要 研究三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）对人脑胶质瘤细胞辐射增敏作用及诱导细胞凋亡。用 3H-TdR 掺入 法、免疫组织化学法、流式细胞术和激光共聚焦显微镜扫描技术检测细胞 DNA 合成、雌激素受体表达、细胞 凋亡及凋亡的形态学特征。结果表明，TAM 能抑制细胞 DNA 合成，与 60Co 线联用抑制作用增强，表现出 协同作用。TAM 能诱导细胞凋亡，其凋亡率随 TAM 浓度的升高而增高，凋亡细胞核固缩和核碎裂，可见凋 亡小体。而免疫组化结果显
3、示 SHG-44 细胞不表达雌激素受体。以上结果表明 TAM 可能通过诱导细胞凋亡途 径来增加细胞的辐射敏感性，而与雌激素受体途径无关。 关键词 三苯氧胺，脑胶质瘤细胞， 辐射增敏，凋亡 中图分类号 R811.5，R730.5，R739.4 雌激素受体（Estrogen receptor，ER）在体内的 分布已远远超出经典靶组织的范围，在端脑、下丘 脑、垂体、脊髓均有雌激素受体的表达，且 ER 在脑内包室旁核、视上核和海马区等部位均有较高 表达1。研究资料表明，在脑胶质瘤中，有部分细 胞可表达雌激素受体2。TAM 是一种非类固醇类抗 雌激素药物，临床上主要用于治疗乳腺癌。近年来 国外研究发现
4、TAM 还可治疗脑胶质瘤，增加胶质 瘤细胞的辐射敏感性，但机理尚不清楚。本工作从 细胞凋亡途径和雌激素受体途径研究了 TAM 对脑 胶质瘤细胞的增殖抑制作用和辐射增敏作用，初步 探讨了 TAM 增加细胞辐射敏感性的机理。 1 材料和方法 1.1 材料 人脑胶质瘤细胞株（SHG-44） ，由苏州大学附 属第一人民医院脑研室提供； TAM （分子量 371.5） 、 吖 啶 橙 （ Acridineorange, AO ） 染 料 、 溴 乙 锭 (Ethidiumromide，EB)染料：购自 sigma 公司；1640 培养基（Roswell park memorial institute，R
5、PMI）购 自 Gibcolc 公司；小牛血清购自杭州四季青生物工 程公司； 3H-TdR 购自中国科学院上海应用物理研究 所；雌激素受体检测试剂盒购自福州迈新生物技术 开发有限公司；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购 自 BD Biosciences 公司；液体闪烁计数仪（瑞典法 码西亚公司） ；流式细胞仪（美国贝克曼公司） ；激 光共聚焦显微镜（德国莱卡公司） 。 1.2 方法 1.2.1 3H-TdR 掺入法检测脑胶质瘤细胞 DNA 合成 取对数生长期细胞，常规消化制备成单细胞悬液， 接受 2Gy 的 60Co 线照射，剂量率 1Gy/min。照射 结束后，加入 TAM 使终
6、浓度为 2、5、10mol/L。 隔日换液，每孔加入 3H-TdR 10L（2.4104 Bq） 。 72h 后消化细胞，将细胞收集到 49 型玻璃纤维滤膜 上，烘干滤膜片，在液体闪烁计数器上测量每个样 品的每分钟计数（Counts/min）值。计算 DNA 合成 抑制率=（对照组 Counts/min 值-实验组 Counts/min 值）100%/对照组 Counts/min 值。 1.2.2 免疫组化测定 SHG-44 细胞雌激素受体 将 细胞接种于置有载玻片的培养皿内，72h 后取出玻 片，依据雌激素受体检测试剂盒说明书操作：磷酸 盐缓冲液（Phosphate buffered sal
7、ine，PBS）冲洗， 加入过氧化物酶，一抗，PBS 冲洗，加入二抗，链 霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，二氨基联苯胺 （Diaminobenzidine，DAB）溶液，苏木青复染，脱 184 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 第 24 卷 水，透明，树胶封固。阳性细胞判断标准:ER 均以 肿瘤细胞核内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细 胞，以每张切片中阳性细胞率20%作为阳性。 1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将细胞接种于 50mL 培养瓶中，24h 后照射组 60Co 线照射 2Gy， 剂量率 1Gy/min，TAM 处理组加入 TAM 工作液使 终浓度为 2、10mol/L。继
8、续培养 48h，常规消化制 备成单细胞悬液；用预冷的 PBS 离心洗涤 2 次，然 后重悬在 1结合缓冲液中，调整细胞浓度为 1106/mL；取 0.1mL 细胞悬液于流式管中，分别加 入 5L Annexin V-FITC 和 5L PI；混匀，避光室温 放置 15min；加入 400L1结合缓冲液，检测细胞 的凋亡率。 1.2.4 激光共聚焦显微镜观察 将细胞接种于置有 载玻片的培养皿内，培养 24h 后照射，加 TAM 处 理同 1.2.3，48h 后将载玻片上的细胞用 PBS 漂洗 1 遍，加入 AO/EB 染液，37染色 10min，取出载玻 片，在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态。
9、1.2.5 统计分析 实验结果采用社会科学与统计软 件包 (Statistical package for social science，SPSS)检 验分析，数据以xs,表示，组间比较采用 t 检验。 2 结果 2.1 TAM 对脑胶质瘤细胞 DNA 合成抑制的影响 从图 1 可见，2mol/L 的 TAM 处理组，DNA 合成抑制率为 5.5%，2Gy 照射组，细胞 DNA 合成 抑制率为 7.7%，TAM+照射组，细胞 DNA 合成抑 制率为 34.1%， 高于单独照射组和 TAM 处理组， 且 显著大于两者单用之和（p0.01） 。5、10mol/L 的 TAM 分别和 2Gy 照射联
10、用，其 DNA 合成抑制率 也高于单独照射组和 TAM 处理组， 且大于两者单 用之和（p0.01） 。说明 TAM 显著增加了 60Co 线对脑胶质瘤细胞杀伤作用，增强了细胞的辐射 敏感性。 Fig.1 The radiosensitizing effect of tamoxifen on SHG-44 cells 2.2 SHG-44 细胞雌激素受体免疫组化染色结果 图 2a 可见雌激素受体阳性的乳腺癌细胞核呈 棕黄色或深棕色，图 2b 可见，SHG-44 细胞染色与 阳性对照结果相反，SHG-44 细胞核无棕黄色或深 棕色染色。随机计数 200 个细胞（1000） ，发现 SHG-44
11、细胞核均无阳性染色， 说明 SHG-44 细胞不 表达雌激素受体。 Fig.2 Immunohistochemistry of the estrogen receptor ( a: Breast cancer cells showed intense brown staining of the nuclei and were stained brown or black brown, b: SHG-44 cells showed no positive reaction in the nuclei and plasma. 1000) 2.3 TAM、60Co 线照射对 SHG-44 细胞凋亡率
12、 的影响 由表 1 和图 3 可见，对照组细胞凋亡率很低， 只有 2.05%，经 TAM 处理后，随着 TAM 浓度的增 加，细胞的凋亡率也增高。当 10mol/L 的 TAM 处 理时凋亡率为 19.00%， 2Gy 的 60Co 线照射凋亡率 为 9.38%，两者联用，凋亡率为 34.40%，大于两者 单独应用时凋亡率的相加，表现出明显协同作用 （p 0.01） 。 第 3 期 宁 萍等：Tamoxifen 联合 线照射对脑胶质瘤细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用 185 Table 1 Effect of apoptosis rate on SHG-44 cells treated with
13、tamoxifen alone or combined with 60Co -irradiation （ x s） Number Group Apoptosis rate / % I Tamoxifen Tamoxifen 0mol/L 2.050.28 II Tamoxifen Tamoxifen 2mol/L 7.660.52(1) III Tamoxifen Tamoxifen 10mol/L 19.000.77(1) VI -irradiation - irradiation 2Gy 9.380.57(1) V -irradiation +tamoxifen - irradiation
14、 +tamoxifen 2Gy + 2mol/L 10.500.60(1) VI -irradiation +tamoxifen - irradiation +tamoxifen 2Gy + 10mol/L 34.400.93(1) (2) Compared with I, (1) p0.01, Compared with III and IV (2) p0.01 Fig.3 The rate of SHG-44 cells apoptosis detected by flow cytometry. (a: tamoxifen 0mol/L, b: tamoxifen 2mol/L, c: t
15、amoxifen 10mol/L, d: 2Gy, e: 2Gy+tamoxifen 2mol/L, f: 2Gy+tamoxifen 10mol/L) 2.4 激光共聚焦显微镜观察 TAM 和 60Co 线诱 导 SHG-44 细胞凋亡的形态学特征: 从图 4a 可见， 细胞经吖啶橙和溴乙锭染色后对 照组细胞形态完整，伸出典型的细小突起，细胞核 被染成明亮的绿色。 图 4b 显示， SHG-44 细胞经 2Gy 照射联合 10mol/L TAM 处理后可见凋亡细胞， 凋亡 细胞呈黄绿色或橙红色，死亡细胞核固缩呈红色。 随着 TAM 浓度的增高， 在激光共聚焦显微镜下观察 到的凋亡细胞和死亡细
16、胞增多。凋亡细胞核染色质 聚集在核膜下呈半月形或指环状，核固缩或核碎裂。 Fig.4 Morphologyical changes of SHG-44 cells (a: tamoxifen 0mol/L ,the shape of SHG-44 Cell was intact and showed no signs of apoptosis , cellular nucleus was stained bright green. b: irradiation 2Gy + tamoxifen 10mol/L, cells became round and apopototic cell was
17、 stained flavo-green or salmon color,and karyopyknosis, nuclear fragmentation and apoptotic body were observed . 630) 186 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 第 24 卷 3 讨论 TAM 是临床上广泛用于治疗乳腺肿瘤的非类 固醇类抗雌激素药物，近年来国外研究发现 TAM 还可治疗脑胶质瘤。 本实验表明，TAM 在体外确实 能抑制脑胶质瘤细胞 DNA 合成，且抑制作用呈浓 度依赖性。当 TAM 和照射联用，其 DNA 合成抑制 率均大于单独照射组与 TAM 处理组，
18、且显著大于 两者单用时 DNA 合成抑制率之和（p0.01） ，说明 TAM 显著提高了脑胶质瘤细胞SHG-44对 60Co 线 的辐射敏感性。 Brondan 等3曾发现在脑胶质瘤细胞 U-373，U-87 中，15mol/L 的 TAM 和 射线联合 作用能使两种细胞的 D0值分别下降 5 和 4 倍。 文 献4报道 15mol/L 的 TAM 无论在照射前、 照射后， 照射时给药，均能提高小鼠脑胶质瘤细胞C6的放射敏 感性， D0值由 （3.790.25） Gy下降到 （2.640.04） Gy。 TAM 的药理性质是抗雌激素， 与雌二醇竞争结合雌 激素受体，从而抑制肿瘤细胞的生长。然而
19、，实验 表明 SHG-44 细胞不表达雌激素受体， 说明 TAM 抑 制 SHG-44 细胞生长可能不是通过抗雌激素作用介 导的。 细胞凋亡是维持机体平衡，控制细胞数量，对 抗异常细胞增殖的机制之一。凋亡细胞和正常细胞 在跨膜的通透性上有很大的不同，AO 能进入胞膜 完整的细胞，与 DNA 结合后使核发出明亮的绿色 荧光；EB 能渗入胞膜受损的细胞，与 DNA 结合发 出橙红色的荧光。 细胞凋亡有其独特的形态学特征： 细胞皱缩，染色质浓聚且位于核膜的边缘，细胞质 膜的发庖现象，特异的凋亡小体形成。本实验观察 到 10mol/L 的 TAM 作用于胶质瘤细胞 48h 后，经 AO/EB 染色，在
20、激光共聚焦显微镜下就能观察到 SHG-44 细胞形态学特异性改变。当细胞经 2Gy 照 射联合 10mol/L TAM 处理后凋亡细胞增多，凋亡 细胞核染色质浓缩，聚集在核膜下呈半月形或指环 状，核固缩或核碎裂，可见凋亡小体形成。早期凋 亡细胞核染色质呈黄绿色，晚期凋亡细胞与死亡细 胞核染色质分别呈橙红色和红色。 在细胞凋亡过程中，既有细胞核 DNA 裂解等 生物化学变化，又有细胞膜中磷脂酰丝氨酸残基暴 露到细胞外等细胞膜表面分子结构改变。因此，本 实验根据细胞发生凋亡时，细胞膜磷脂酰丝氨酸外 翻，可与发绿色荧光的 Annexin V-FITC 结合的原 理，以 Annexin V-FITC
21、Apoptosis Detection Kit I 来 检测细胞凋亡率。实验证实，TAM 处理胶质瘤细胞 48h，能明显诱导细胞凋亡，其凋亡率随着 TAM 剂 量的增大而增加。当 10mol/L 的 TAM 和 2Gy 的 60Co 线照射联用时，其凋亡率大于两者单独应用 时凋亡率的相加，表现出协同作用（p0.01） 。这表 明 TAM 增加了射线对脑胶质瘤细胞的凋亡诱导作 用。已有许多研究结果显示5,6，凋亡反应的增加， 提示细胞具有更大的辐射敏感性。曹锐峰等7比较 了两种胶质瘤细胞系SHG-44和C6的凋亡率与辐射 敏感性的关系，发现 射线诱导 SHG-44 细胞的凋 亡率高于 C6细胞，
22、 相应地 SHG-44 细胞的辐射敏感 性也高于 C6细胞。 此外， 凋亡反应的速率也与辐射 敏感性有关， 快速凋亡的细胞具有高的辐射敏感性。 Olive等8研究了两种细胞株TK6和WI-L2-NS的凋 亡速率与辐射敏感性的关系， 发现 TK6 细胞的辐射 敏感性高于 WI-L2-NS 细胞，这是因为 TK6 细胞在 照射后 24h 内凋亡，而 WI-L2-NS 细胞在照射后几 天内才发生凋亡。 本实验证实 TAM 在体外能抑制胶质瘤细胞 DNA 合成，提高脑胶质瘤细胞的放射敏感性；且 TAM在低浓度 2mol/L时就能引起 SHG-44 细胞凋 亡，且凋亡率随着 TAM 浓度的增加而增高；而
23、脑 胶质瘤细胞不表达雌激素受体。这说明了 TAM 抑 制细胞 DNA 合成，增加细胞的辐射敏感性可能与 其诱导细胞凋亡有关。 TAM 是一种能透过血脑屏障 且对人体毒副作用较小的药物，阐明 TAM 和照射 产生协同作用， 增加肿瘤细胞的辐射敏感性的机理， 对于开发 TAM 药物新用途和临床脑胶质瘤的放射 治疗具有重要意义。 致谢致谢 本研究得到放医公卫学院中心实验室李冰 燕老师的大力帮助，在此表示感谢。 参考文献 1 李艳, 张平安. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2002, 23(4): 214-215 LI Yang, ZHANG Pingan. Foreign Med Sci, 2
24、002, 23(4): 214-215 2 Leslie K K, Keefe D, Powell S, et al. J Soc Gynecol In- vestig, 1994, 1(3): 238-244 3 Brondan da Rocha A, Mans D R, Bernard E A, et al. Eur J Cancer, 1999, 35(5): 833-839 4 Zhang W, Yamada H, Sakai N, et al. Neurosurgery, 1992, 31(4):725-729; discussion 729-730 5 Hoffmann W, Sc
25、hiebe M, Hirnle P, et al. Int J Cancer, 1997, 70 (4): 475-477 6 Lang F F, Yung W K, Raju U, et al. J Neurosurg, 1998, 89(1): 125-132 7 曹锐峰, 章翔, 曹云新, 等. 第四军医大学学报, 2003, 第 3 期 宁 萍等：Tamoxifen 联合 线照射对脑胶质瘤细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用 187 24(22): 2051-2055 CAO Ruifeng, ZHANG Xiang, CAO Yunxin, et al. J Fourth Mil Med U
26、niv, 2003, 24(22): 2051-2055 8 Olive P L, Banh J P, Durand R E. Radiat Res, 1996, 146(6): 595-602 Effect of tamoxifen combined with 60Co -irradiation on proliferation inhibition and apoptosis induction in human glioma SHG-44 cells NING Ping1,2 LIU Fenju1,2 XUE Jing1 1(School of Radiation Medicine an
27、d Public Health, Suzhou University, Suzhou 215123) 2(The Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection of Jiangsu Province, Suzhou University, Suzhou 215123) ABSTRACT To study radiosensitizing effect and apoptosis induction of tamoxifen on human glioma cells, 3H-TdR incorporation assay, flow c
28、ytometry, laser confocal microscope and Immunohistochemistry were used to investigate the inhibition effect on DNA synthesis, apoptosis and estrogen receptor expression. Experiment results suggested that tamoxifen could inhibit DNA synthesis in SHG-44 cells,the combination of tamoxifen and 60Co -irr
29、adiation showed a synergistic action on it. Tamoxifen could also induce the apoptosis, and the apoptosis rate increased along with tamoxifen concentration was elevated, so morphologyical changes, such as karyopyknosis, nuclear fragmentation and apoptotic body were observed. However, SHG-44 cells did
30、 not express estrogen receptor. The above results revealed that tamoxifen can sensitize SHG-44 cells to gama radiation, which might be related with apoptosis pathway instead of the estrogen receptor-mediated process. KEYWORDS Tamoxifen, Glioma, Radiosensitivity, Apoptosis CLC R811.5, R730.5, R739.4