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1、4 3 8 .中国生物制品学杂志2 仪 犯年5 月第21卷第5 期 C 卜 i n J Bi o l哈司. M ayZ (X 龙 ， Vol . ZINo. 5 中 国 图 书 分 类 号 切 肠 。 . 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 份( 绷 )肠 实验技术】 T ri to n x 1 14萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素 王雪筱王建华 摘要 】 目 的 采用Triton x-ll 4 萃取法去除A 群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1 %Triton 芜11 4 与多糖溶 液在0 混合均匀， 分别加热至25、 37和56， 观察分层情况。 离心后收集上层水相， 对其中残
2、余萃取剂T ” t o n x-l l4进行去除 方法的选择。比 较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果， 并对终产物进行全面检定。 对w 1 35群和Y 群脑膜炎球菌多糖 进行萃取效果比 较。结果 最终选择5610而 n 作为升温条件， 3 J X r/ 而 n 离心10而 n 后， 上清中多糖的内 毒率含量均减少 85%以 上， 多糖回收率不低于50%。残余的T 对 10 n 1 14选择透析法去除。 多糖浓度越低， 越易于萃取。二次萃取多糖回收率 大于85 % 。 内 毒素 含量 可降 低至0 . 溉 E U 介 唱 多 糖。 经 检 测， 终 产 物多 糖的 相 对分子 质量未发 生改
3、 变， 免疫 原性与 萃 取前差 异无显著意义， 异常毒性、 多糖及内 毒素含量合格。 蛋白 含量稍有增加， 核酸含量降低。 w 1 35群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃 取结果与A 群多糖相似。结论 Trito n x-l l4萃取法可以 用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。 【 关键词】 脑膜炎球菌; 荚膜多糖; 内 毒素; 萃取; T ” t o n 芜1 14 F 决 m o v a l ofE n dot o 劝 nfr 0 m C a P s ul ar Po1 y sa cchari d esofMe n i ng0 c 0 c cus G rou pA 勿 Ext r a ctio n
4、初t hT ri to nX 1 1 4 确 叭 人 GX ue 一 wei ， W A N GJi an七 u a ( Na油nal 认 ZC c ine 。 声 己 盯印 卜 撇c haride ; E n d OI 比 石 n ; 公 坛 朗 t ion ; T ” t o n 芜 1 14 内毒素的脂多糖与细菌荚膜多糖结构相似， 因 此， 很难从荚膜多糖中去除污染的内毒素L ，2 。 本 实验以脑膜炎球菌荚膜多糖为研究样品， 利用荚膜 多糖的亲水性和内毒素脂多糖的疏水性， 采用Triton x-l l4作为萃取剂， 萃取去除其中的内 毒素s， 4 1 ， 获 得较好的效果， 显示萃取法
5、可应用于脑膜炎球菌荚 膜多糖的纯化。 作者单位: 北京生物制品研究所细菌研究室( 北京1 朋 倪4 通讯作者: 王雪薇， E-II 1 : wxw 一 1 2 251 63 1 . 材料与方法 1 . 1 材料 A 群、 W 13 5 群和Y 群脑膜炎球菌荚膜多 糖由 本 室提供; Triton x 一 1 14为si g lla 公司产品; 赏试剂( 灵 敏度0 . 25EU/ 而) 、 内毒素工作标准品( 10E U / 而) 、 内毒素检查用水( 2夕 侧 )28 . 5 287. 肠 25 xl 护28. 441 76 l XX) 0 . 05) 。表 方法。卜明多糖样品的免疫原性基本
6、未改变， 见表40 2.6 终产物的检定2. 6. 7 异常毒性试验: 注射萃取后终产物7 d 后， 小 2 . 6 . 1多糖含量: 萃取前原液为40 3 . 4 户 岁 耐， 萃取鼠 和 豚鼠 均健存， 无异常反应， 体重增加， 异常毒性 后为3 541上 岁 而， 回 收率为8 7 . 8 %。试 验合格。表明萃取过程中引人的Triton x 一 1 14经 2 ， 6 . 2 内 毒素 含量: 萃 取前 原液 为1 2 39. S E U / 滩多透 析 后的 残 余 含 量不 会引 起异常 毒 性。 糖， 萃取后为0 . 7 06Eu/ 鸿多糖， 去除率为99. 9 % 。2. 7与
7、w l 书和Y 群脑 膜 炎 球菌多 糖 萃 取 效 果比 较 2 . 6 . 3 蛋白含量: 萃取前原液为7 . 881丈 岁 而， 即检测结果显示， 应用萃取法去除W 1 35群及Y 19. 7 1 11 9 / 9 ; 萃取后为8 . %乒 娜d， 即25. 3 111岁 9 。群脑膜炎球菌 多糖中的内 毒素， 去除 率均达到99%， 2 . 6 . 4 核酸含量: 萃取前原液为8 ， 25“ 岁 耐， 即多 糖回 收率 在85%以 上， 与A 群脑膜炎球菌多 糖的 20. 6 251玛 好 9 ; 萃 取 后 为1 . 35拜 9/ 而， 即3 . 3 75n l g/ g 。结 果
8、一 致， 见 表50 表2 不同浓度多糖萃取效果的比较 T ab Z . D川o t o 泪 的田 目州 诵 y 掀 c ha南e o 阅 盆 犯 n tsin朋 盯 IP lesat丫 团 n o . c . 侧 叉 咐口蛇 呢 0 川 c e n tlat i 丽( 尸 岁间)咫( 拜 留血)Er(EU/而)E r / PS( E U/绍)R e ll 刃 v a ( %)巧， 叮( %) s xl 护 5 X 旧 !23 9 . 50 1 . 49 1 . 34 122 卯 . 8 8 卯 . 89 99 . 00 83 . 以 92 . 2 1 1 oo 4 . 内J气弓Q矛 nU飞了
9、八曰 月峪，J内，1月崎 呱800朔200 表3 二次萃取的效果比较 T 曲3 . D 闭01 比 泪 巨田 日州y 圈 口 山 国 凶 触。 。 n t e n 坛加 川 璐e xt . d 目肠 r Z 舫 I r 比 ， 励 叨 p l e B u l k ISt e 吐 介 址t i 佣 Znd e 叉 t mdi on 玲( 拜 酬d)盯( E U/时)E I，/ 邢( E U 介 唱 ) R e 侧v 目 ( %)玲到 筑 笼 即 曰 ， ( %) 如 3 . 4 3 94 . 2 3 54 . 0 s xl 护 25 (X) 2 又】 123 9 . 汉刃 6 . 明0 0 7
10、肠 卯 . 40 8 8. 86 卯 . 7 89 . 8 表4 免疫小鼠血清抗体水平 1 恤 b4 . E L 】 S A柱 ter 成咫 n 口 ”朋廿 加 刃 y健加 1 1 1 1 皿j 双 月而ce 旧 液 肠 ， 记 e 川n 妞 t i o 们人 丑e re x 加祀t i 伪1 P 此 i t i ve n 戒 e( %)B 阅 讯 ven 劝 e ( %) 表5 萃取法去除W1 35群及Y群脑膜炎球菌多糖中内毒素结果 T 曲 5 . R 即 阳 ， 目仗曰 川 说 训 勿丘 . nCa阳j 】 arP 日 y sa 。 如 盯 记 启了N. 蒯耐 吧角 泌 留田 曰少 . 耳
11、 活Ya l 日W】 35 Q训p玲( 户 岁耐)Er( E U / d)玲践 戈 幻 ， e ry( %) Er w 目( %) 5 xl 07 s xl 护 2又力 2 5 85 . 73 .89482862588 30览67.旅 俪枷 万方数据 中 国 生 物 制品 学 杂志万 】 犯 年5 月 第21卷 第5 期 C n J Bi d 硒。 dsM 叮刀 】 月 ， vol. 21、. 5 44 1 3 . 讨论 采用 1 %浓度的Trit o n X 1 14在多糖水溶液中对 内 毒素进行萃取， 先降温至0 ， 充分混匀成一相， 再升温至云点以上， 使之分层， 由实验结果可以看 出，
12、 室温和37分层均很困难， 56分层较容易。 因此， 选择56作为最终温度。加热 10而n 后很容 易离心分层， 吸取上层水相， 经透析除去其中残余的 Triton x 一 1 14， 结果较好地去除了内毒素。对内毒素 含量高于 1 护E U/而的样品， 每次萃取可使内毒素 含量减少至原来的1 /l XX) 0 在去除Triton 芜1 14的实验中， 透析法和凝胶过 滤法均能很好地去除Triton X 一 1 14， 由于凝胶过滤法 多糖损失约20%， 本实验最终选择透析法。( 中国 药典 三部恤刃 5 版) 中 对Triton x 一 1 00的残余量规定 为: 半成品中 不得大于巧拼 岁
13、 而， 人用剂量可控制在 7 . 5 尸 9/ 支。 本实验得到的半成品中， Triton x-l l4残 余量约为5 拼 9/ 而， 人用剂量可控制在0 . 5 科 酬 d 支 以下( 按A群脑膜炎球菌多糖疫苗剂量计算) 的水 平， 远远低于药典的规定。终产物异常毒性试验合 格， 也说明在该残余含量下， 产物安全性良 好。 多糖浓度对萃取效果的影响试验结果显示， 多 糖浓度越低越容易萃取， 萃取后多糖回收率越高。 二次萃取试验显示， 内毒素含量可以达到所要求的 水平， 而多糖回收率仍可达85%以上。萃取法处理 前后样品的理化和生物学性质检定结果显示， 蛋白 含量稍有增加， 核酸含量降低， 相
14、对分子质量未改 变， 异常毒性检查合格， 免疫原性与处理前差异无显 著意义。 尽管萃取法存在许多不足， 如加人去污剂和高 温都可能会造成荚膜多糖不稳定， 易于降解， 处理后 的 抗原稳定性还应作进一步的 研究e， 7 。但由于革 兰阴性菌内毒素的脂多糖与荚膜多糖结构很相似， 目 前所报道的许多其他方法， 如亲和层析法 “ 一 0 、 活性炭吸附法 ” 、 微孔膜分离法 2 等都难以分离， 因此萃取法也不失为去除荚膜多糖中内毒素的一种 有效方法。 参考文献 【 11张顺财. 内毒素基础与临床. 北京: 科学出版社渗刃 3 . 3 7 9 一 391 . 【 2 肠诬此 如Y ， 苟 山N ， 加
15、e 匕K ， etal. C 卜 axac t eri币 c bi o 】哈司 即 d vi ti esJ 1 1闪网y 坛 d .丘 扣 S in 耐tiZ 山ium 田 记M 住 叨 五 讼 为 1 旧. J D 记 d 瓜 勿 R ， 2 (X 拜， ro( 1 ) : 25一 31. 【 3 儿 山Y ， P 目 减MJ. 凡 ” 脚 日of印 d OI 0 x in 压 加p 以 e in 即 l u t i。 勿川 .毗 叫 呷 耐1 即朋 】邓Tri切 x-n 4 . J 玩 口 uno 1 M e th 以 如 ， 1 9 哭 ) ， 1 32( 2): 191 - 1 95
16、. 4 A ds 叨0 ， v 1 1能 A ， B 川 I F ， etal . An 0 I记 气 犷 园 川 ive二tefor阮 二 - 咖哈 目苗曰 日 说 以 石 ”丘 冈 l e x 哪 d y h 面d 即. 人 刀 目B ioc 卜 二 ， 1 卯5 ， 2 25 ( 2): 321 一 3 27. 【 5 汪家政， 范明. 蛋白质技术手册. 北京: 科学出版社， 2 以 刀 . 72-74 . 【 6 秦峰， 刘学良， 魏桂林， 等. 生物医药制剂中内毒素去除研究进 展. 药物生物技术澎刃 3 ， 1 0(1 ) : 53一 56. 【 7 蔡慧丽. 生物技术药品分离纯化过
17、程中内毒素的去除 海峡药 学， 2 X 巧 ， 1 8 ( 2 ) : 1 5 7 一 1 59. 【 幻A m . 1心 lx M c ， H 咫 护E ， 往D ， et 公 . A new meth 记for此 n x ” 八 n g 印 d ot ox - in丘 臼 l l P l asamauSIn g h 价 现 姆 石 b 】 e 面ni tyc h 阴皿 ( 嗯 耳 甲 h y t ec hi lo 】 0 . 留， 即 p l i c 曲 l e for卿花 司住 七 田 幻 发 ” t of卿t i c 叫ients . J E 司 川 o x i n R 朋， Z IX
18、 岭 ， 10( 2): 85. 95. 【 9 九 】 从 呱以 Mc， Raj盖甲 ak e N ， H 嘟i E ， d 公 . E l司 d o 石 11 祀 1加 v 目 台 以 刀 油 。 le 日 以 d场a nOVe l 目 助 印 t 油 : 抓ci en c y 田 翻 h 曰 1 锐溯1劝ibili ty . 玩J A n 汪 o r 脚IB ， 2 以 ” ， 27(6 ) : 刃 4 的. 【 ro 唐守万， 孔亮， 欧俊杰， 等. 柱亲和介质用于内毒素去除的研究. 分析化学， 2 以 万 ， 34( 4): 45 5 458 . 【 川 金礼琴， 叶灯凤. 胞磷胆碱
19、钠注射液制备工艺的改进. 中国生化 药物杂志， 2 以 ” ， 25( 6): 3 57 一 3 58. 【 12氏UC M ， C 七 OK ， W 白 记 e l HP. E 以 Id o x i n花 n 扣 v al俪m司 h u ln i n田 记 喇 如 e so l u t i 呱. IntJ A lt if o 理 冲 拍 ， 么 犯 7 ， 30( 7): 5 89一 5 93. ( 收稿日期曰洲 刀 一 能一) 欢迎登录 中国生物制品学杂志 网站 尊敬的专家、 读者、 作者及各位同仁: 您们好! 自2 以 y7年5 月 起， 中国 生物制品 学杂志 网 站( www . 叹 笋 叼 . c om. cn， 中 文域 名: 中国 生物制品 学杂志. 二 ) 正式运 行。 本站 网页有杂志简介、 在线投稿、 稿件查询、 过期目录、 广告合作等您所需要的信息， 欢迎登录。 万方数据