VIP对人脐血CD34细胞向肝系分化的影响初探.pdf

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1、V I P对人脐血C D 3 4 +细胞向肝系分化的影响初探* 王利1 , 2,唐承薇1 ,王春晖1,李献1,强欧1,黄明慧1 1 .四川大学华西医院 人类疾病生物治疗教育部重点实验室 人类疾病相关多肽研究室(成都6 1 0 0 4 1 ) ; 2 .重庆医科大学附属第一医院 血液科 【摘要】 目的探讨血管活性肠肽( VI P )对人脐血造血干细胞( HS C )向肝系分化的影响。方法采用免疫磁 分选技术纯化人脐血C D 3 4 +细胞, 流式细胞术鉴定纯度; VI P和混合因子(包括VI P 、 E G F 、 HG F )作用C D 3 4 +细胞 后,酶联免疫化学法测定C D 3 4 +

2、细胞及上清 AF P水平,免疫细胞化学法检测C D 3 4 +细胞上肝系标志 AF P 、白蛋白 ( AL B ) 、细胞角质素1 9 ( C K- 1 9 )的表达, We s t e r nb l o t方法检测C D 3 4 +细胞上 AL B表达;巢式R T- P C R方法检测 C D 3 4 +细胞上AF P 、 AL B的mR NA表达, 随机选送AL B产物测序。结果免疫组化结果显示C D 3 4 +细胞上不表达 C K- 1 9蛋白,但有AF P和AL B蛋白表达; VI P作用C D 3 4 +细胞1 4d后,细胞内的AF P质量浓度( 1 6 5 . 0 0 8 . 5

3、1p g / mL )较对照组( 2 7 0 . 0 0 1 1 . 3 7p g / mL )显著下降( P ; 7 ? ; A = ; B5 = CDE FA 945 7 ; A 7 ; 7 ,G = A = ;H; IJ A K 8 L A = 8 L I 8 :M 5 8 = C ; L A 0 . 0 5 ) ;上清液质量浓度分别为( 3 6 0 . 0 0 1 1 . 3 2 )p g / mL 、 ( 3 5 2 . 5 0 9 . 6 9 )p g / mL ,较对照组( 5 7 1 . 2 5 1 2 . 7 6 )p g / mL下降3 6 . 9 8 %( P0 . 0

4、5 ) 、 3 8 . 2 9 %( P 0 . 0 5 ) 。 2 . 4 V I P对人C D 3 4 +细胞表达 A L B的影响 图1 V I P对C D 3 4 +细胞表达A F P的影响。D A B 4 0 0 图2 V I P对C D 3 4 +细胞表达A L B的影响。D A B 4 0 0 F i g1 T h ee f f e c t o f V I Po nt h ee x p r e s s i o no f A F Pi nh u ma nC D 3 4 +c e l l s .D A B 4 0 0F i g2 T h ee f f e c t o fV I Po

5、nt h ee x p r e s s i o no f A L Bi nh u ma nC D 3 4 +c e l l s .D A B 4 0 0 A:C o n t r o l 1 4d ;B :VI P1 4d ;C :VI P +HG F +E G F1 4d ;D :Ne g a t i v ec o n t r o l 085 四川大学学报(医学版)2 0 0 6年第3 7卷第4 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =

6、= = = = = = = = = = = = = = = = 期 2 . 4 . 1 免疫组化结果部分人C D 3 4 +细胞胞浆呈 棕褐色颗粒状着色,为AL B阳性细胞, VI P组、混合 因子组均有阳性细胞。见图2 。 2 . 4 . 2 免疫印迹加入AL B多克隆抗体后,显色 曝光可见各组均有单一条带出现,即为AL B蛋白, VI P作用组、 混合因子组表达较对照组有减弱趋势 (图3 ) 。 图3人C D 3 4 +细胞上A L B表达 F i g3 E x p r e s s i o no f A L Bi nh u ma nC D 3 4 +c e l l s A: VI P1 4

7、d ;B : VI P +HG F +E G F1 4d ;C : C o n t r o l 1 4d ;D : He p G2 ;E : C D 3 4c e l l s 2 . 5 A F PmR N A表达 人 脐 血 MNC和C D 3 4 + 细 胞 都 表 达 AF P mR NA,巢式R T- P C R外引物产物大小是3 9 5b p ,最 终产物大小是2 8 2b p 。内对照采用G AP D H,产物大 小是2 4 0b p (图4 ) 。 图4人脐血C D 3 4 +细胞上A F P表达 F i g4 E x p r e s s i o no f A F Pi nh u

8、 ma nc o r db l o o dC D 3 4 +c e l l s 1 , 2 , 5 , 6 :MNC ;3 , 4 , 7 , 8 :C D 3 4 +c e l l s 2 . 6 A L BmR N A表达 人脐 血 MNC和C D 3 4 +细 胞 都 表 达 了 AL B mR NA,巢式R T- P C R外引物产物大小是4 2 2b p ,最 终产物大小是3 2 2b p 。内对照采用G AP D H,产物大 小是2 4 0b p (图5 ) 。 2 . 7 测序结果 AL B巢式R T- P C R产物进行测序, 测序结果与 G e n B a n k中AL B基

9、因序列( 序列号: NM 0 0 0 4 7 7 ) 进行同源性比较,无一个碱基错配,结果如下: 3 - AG AG G T C T C AAG AAAC C T AG G AAAA- 图5人脐血C D 3 4 +细胞上A L B表达 F i g5 E x p r e s s i o no f A L Bi nh u ma nc o r db l o o dC D 3 4 +c e l l s 1 , 2 , 5 , 6 :MNC ;3 , 4 , 7 , 8 :C D 3 4 +c e l l s G T G G G C AG C AAAT G T T G T AAAC AT C C T G

10、 A- AG C AAAAAG AAT G C C C T G T G C AG AAG AC T- AT C T AT C C G T G G T C C T G AAC C AG T T AT G T- G T G T T G C AT G AG AAAAC G C C AG T AAG T G A- C AG AG T C AC C AAAT G C T G C AC AG AAT C C T- T G G T G AAC AG G C G AC C AT G C T T T T C AG C T- C T G G AAG T C G AT G AAAC AT AC G T T C C

11、C AA- AG AG T T T AAT G C T G AAAC AT T C AC C T T C C - AT G C AG AT AT AT G C AC AC T T T C T G AG AAG- G AG AG AAT C C - 5 。 3 讨论 胎肝细胞被认为来源于肠道内胚层 7 ,8 。有研 究者将男性患者或大鼠骨髓细胞Y染色体着丝粒用 D NA探针特殊标记后, 移植到女性肝病患者或肝衰 竭模型大鼠体内,在受者肝细胞中检测到来自供者 Y染色体特异性标记的物质, 证实新生肝细胞也可 来源于供体骨髓造血细胞 1 ,9 。造血干细胞向肝细 胞分化过程目前尚不清楚,一般认为有分化

12、为肝前 体细胞这一过程 1 0 。肝前体细胞具有肝细胞和胆管 细胞的共同特征,即既表达胎肝细胞标志AF P和 AL B , 也表达胆管上皮细胞标志C K- 1 9 1 1 。 本研究实 验结果表明,人脐血C D 3 4 +细胞表达了 AF P 、 AL B , 但未见C K- 1 9表达。尽管这些标志物在造血干细胞 向肝细胞分化过程中应发生何种改变或具有哪些功 能尚不清楚,但来自中胚层的造血干细胞表达内胚 层细胞标志AF P和肝细胞标志AL B ,更进一步提示 造血干细胞有向肝细胞分化的可能。 目前有两种学说解释造血干细胞向肝细胞分 化: 横向分化,造血干细胞在体内受坏死肝组织微 环境刺激后随

13、血循环到肝脏,向肝前体细胞分化,然 185JS i c h u a nUn i v( Me dS c i E d i )Vo l . 3 7No = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = . 42 0 0 6 后 分 化 为 肝 细 胞 和 胆 管 细 胞 1 1 ; 细 胞 融 合 假 说 1 2 ,造血干细胞随血液循环到肝脏和肝细胞发生 融合,再分化成肝细胞和胆管细胞。但

14、迄今为止,未 发现多倍体的融合细胞出现。 本实验中,我们观察到在人脐血C D 3 4 +细胞培 养体系内加入VI P或多种细胞因子后, C D 3 4 +细胞 AF P表达较对照组显著降低。尽管本实验对AL B 表达未作定量分析,但从免疫组化和免疫印迹结果 可见,受VI P影响,人脐血C D 3 4 +细胞 AL B表达减 弱。VI P也未见诱导C K- 1 9表达。这些肝前细胞标 志物在造血干细胞向肝细胞分化过程中究竟发生什 么样的变化,目前并不清楚,但VI P可以影响造血干 细胞内胚层细胞标志物表达,表明对其横向分化可 能具有抑制作用。人脐血C D 3 4 +细胞向肝细胞横向 分化可能不由

15、某单一因素调控,需要多因素联合作 用,筛选这些因素,对认识造血干细胞向肝细胞分化 的机制有积极的意义。 参考文献 1P e t e r s e nB E ,B o we nWC ,P a t r e n eKD ,e t a l .B o n ema r r o wa s ap o t e n t i a ls o u r c eo fh e p a t i co v a lc e l l s .S c i e n c e ,1 9 9 9 ;2 8 4 ( 5 4 1 7 ) : 1 1 6 8 - 1 1 7 0 . 2L a g a s s e E , C o n n o r s H,

16、Al - D h a l i my M, e ta l . P u r i f i e d h e ma t o p o i e t i cs t e m c e l l sc a nd i f f e r e n t i a t ei n t oh e p a t o c y t e si n v i v o .Na t Me d ,2 0 0 0 ; 6 ( 1 1 ) : 1 2 2 9 - 1 2 3 4 . 3R o g l e r L E . S e l e c t i v e d i p o t e n t i a ld i f f e r e n t i a t i o n o

17、 f mo u s e e mb r y o n i ch e p a t o b l a s t si nv i t r o .Am JP a t h o l ,1 9 9 7 ; 1 5 0 ( 2 ) : 5 9 1 - 6 0 2 . 4C a s c i oS ,Z a r e t KS .He p a t o c y t ed i f f e r e n t i a t i o ni n i t i a t e sd u r i n g e n d o d e r m- me s o d e r ma li n t e r a c t i o n sp r i o rt o l i

18、 v e rf o r ma t i o n . D e v e l o p me n t ,1 9 9 1 ; 1 1 3 ( 1 ) : 2 1 7 - 2 2 5 . 5S a s a k i H,Ni oM,I wa mi D ,e ta l .C y t o k e r a t i ns u b t y p e si n b i l i a r ya t r e s i a :i mmu n o h i s t o c h e mi c a l s t u d y .P a t h o l I n t ,2 0 0 1 ; 5 1 ( 7 ) : 5 1 1 - 5 1 8 . 6N

19、i waY,Ma t s u mu r aM,S h i r a t o r i Y,e ta l .Qu a n t i t a t i o no f a l p h a - f e t o p r o t e i n a n d a l b u mi n me s s e n g e r R NA i n h u ma n h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o ma . He p a t o l o g y , 1 9 9 6 ;2 3( 6 ) :1 3 8 4 - 1 3 9 2 . 7Z a r e tKS . R e g u l a t

20、o r y p h a s e s o fe a r l y l i v e rd e v e l o p me n t : p a r a d i g mso f o r g a n o g e n e s i s .Na t R e vG e n e t ,2 0 0 2 ; 3 ( 7 ) : 4 9 9 - 5 1 2 . 8D e u t s c hG,J u n gJ ,Z h e n gM,e t a l .A b i p o t e n t i a l p r e c u r s o r p o p u l a t i o n f o r p a n c r e a s a n

21、 d l i v e r wi t h i n t h e e mb r y o n i c e n d o d e r m.D e v e l o p me n t ,2 0 0 1 ; 1 2 8 ( 6 ) : 8 7 1 - 8 8 1 . 9Ma l c o l m R A,R i c h a r dP ,R o s e ma r yJ ,e t a l .He p a t o c y t e s f r o m n o n h e p a t i ca d u l t s t e m c e l l s .Na t u r e ,2 0 0 0 ; 4 0 6 ( 6 7 9 3

22、) : 2 5 7 . 1 0S t r a i nAJ ,C r o s b yHA.He p a t i c s t e mc e l l s .G u t ,2 0 0 0 ; 4 6 ( 6 ) : 7 4 3 - 7 4 5 . 1 1D a b e v aMD ,P e t k o vP M,S a n d h uJ ,e ta l .P r o l i f e r a t i o na n d D i f f e r e n t i a t i o n o ff e t a ll i v e re p i t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l

23、 l sa f t e r t r a n s p l a n t a t i o ni n t oa d u l tr a tl i v e r .Am JP a t h o l ,2 0 0 0 ;1 5 6 ( 6 ) : 2 0 1 7 - 2 0 3 1 . 1 2T e r a d aN,Ha ma z a k iT ,Ok aM,e ta l .B o n ema r r o w c e l l s a d o p t t h ep h e n o t y p eo f o t h e rc e l l sb ys p o n t a n e o u sc e l l f u s

24、 i o n . Na t u r e , 2 0 0 2 ; 4 1 6 ( 6 8 8 0 ) : 5 4 2 - 5 4 5 . ( 2 0 0 51 02 1收稿, 2 0 0 60 32 2修回) 编辑汤洁 (上接第5 5 3页) 因此有必要在不同的人群中对E合成和代谢酶基因 进行进一步的多基因病例对照研究,并对有家族史 的I C P患者作家系分析,以期从基因水平更确切地 阐明E与I C P发病的关系。 参考文献 1Mu l l a l l y B A, Ha n s e n WF . I n t r a h e p a t i c c h o l e s t a s i s o f

25、 p r e g n a n c y :r e v i e w o ft h el i t e r a t u r e .Ob s t e tG y n e c o lS u r v , 2 0 0 2 ; 5 7 ( 1 ) : 4 7 - 5 2 . 2 田小芸,孙敬方.妊娠大鼠肝内胆汁淤积症模型的建立.中国 比较医学杂志,2 0 0 3 ; 1 3 ( 1 ) : 2 4 - 2 7 . 3S a v a n d e rM,R o p p o n e nA,Av e l aK,e t a l .G e n e t i c e v i d e n c e o f h e t e r o g

26、 e n e i t yi ni n t r a h e p a t i cc h o l e s t a s i so fp r e g n a n c y .G u t , 2 0 0 3 ; 5 2 ( 7 ) : 1 0 2 5 - 1 0 2 9 . 4 戴钟英.妊娠期肝内胆汁淤积症.见:曹泽毅主编.中华妇产 科学(上册) .第1版.北京:人民卫生出版社,1 9 9 9 : 5 0 0 - 5 0 7 . 5 漆洪波,邵勇,吴味辛等.妊娠肝内胆汁淤积症分度诊断和 处理的临床意义.中华妇产科杂志,2 0 0 4 ; 3 9 ( 1 ) : 1 4 - 1 7 . 6 肖洲生,王连生,朱

27、冰等.细胞色素P 4 5 0酶系.见:周宏灏主 编.遗传药理学.第1版.北京:科学出版社.2 0 0 1 : 5 3 - 1 2 2 . 7Ha i ma n C A, Ha n k i n s o n S E , S p i e g e l ma n D , e ta l . T h e r e l a t i o n s h i pb e t we e nap o l y mo r p h i s m i nC Y P 1 7wi t hp l a s ma h o r mo n el e v e l sa n db r e a s t c a n c e r .C a n c e rR

28、e s ,1 9 9 9 ;5 9 ( 5 ) : 1 0 1 5 - 1 0 2 0 . 8Ama n t F ,D o r f l i n gC M,d e - B r a b a n t e r J ,e t a l .Ap o s s i b l er o l e o f t h ec y t o c h r o mP 4 5 0 c 1 7 a l p h ag e n e ( C Y P 1 7 )p o l y mo r p h i s mi n t h e p a t h o b i o l o g y o fu t e r i n e l e i o my o ma s f

29、r o m b l a c k S o u t h Af r i c a nwo me n : ap i l o ts t u d y .Ac t aOb s t e tG y n e c o lS c a n d , 2 0 0 4 ;8 3 ( 3 ) : 2 3 4 - 2 3 9 . 9Hs i e hYY,C h a n gC C ,T s a i F J , e t a l .E s t r o g e nr e c e p t o ra l p h a d i n u c l e o t i d e r e p e a t a n d c y t o c h r o me P 4

30、 5 0 c 1 7 a l p h a g e n e p o l y mo r p h i s msa r ea s s o c i a t e dwi t hs u s c e p t i b i l i t yt o e n d o me t r i o s i s .F e r t i l S t e r i l , 2 0 0 5 ; 8 3 ( 3 ) : 5 6 7 - 5 7 2 . 1 0Wa n d e l C ,Wi t t e J S ,Ha l l J M,e t a l .C YP 3 Aa c t i v i t yi na f r i c a n a me r

31、 i c a na n de u r o p e a na me r i c a nme n :p o p u l a t i o nd i f f e r e n c e s a n df u n c t i o n a l e f f e c to ft h eC Y P 3 A4 *1 B5 - p r o mo t e rr e g i o n p o l y mo r p h i s m.C l i nP h a r ma c o l T h e r ,2 0 0 0 ; 6 8 ( 1 ) : 8 2 - 9 1 . 1 1Ke s h a v aC , Mc C a n l i

32、e sE C ,We s t o nA.C Y P 3 A4 p o l y mo r p h i s msp o t e n t i a lr i s kf a c t o r sf o rb r e a s ta n dp r o s t a t e c a n c e r :a Hu G E( Hu ma nG e n o me E p i d e mi o l o g y )r e v i e w.AmJ E p i d e mi o l , 2 0 0 4 ; 1 6 0 ( 9 ) : 8 2 5 - 8 4 1 . ( 2 0 0 50 92 2收稿, 2 0 0 60 11 1修回) 编辑汤洁 285 四川大学学报(医学版)2 0 0 6年第3 7卷第4 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 期