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1、中华 人 民共 和 国 农业 行 业 标 准 N Y 2 2 7 一 9 4 微生物肥料 主题内容与适用范围 本标准规定了微生物肥料产品的分类、 技术要求、 试验方法、 检验规则、 包装、 标志、 运输与贮存 本标准适用于有益微生物制成的， 能改善作物营养条件( 又有刺激作用) 的活体微生物肥料制品。 弓 I 用标准 G B 8 1 7 2 蛔虫卵测定方法 G B 4 7 8 9 大肠菌值测定方法 G B 7 4 6 8 总汞测定方法 G B 7 4 7 1 总锡测定方法 G B 7 4 6 6 总铬测定方法 G B 7 4 8 5 总砷测定方法 G B 7 4 7 。 总铅测定方法 3 产品
2、分类 3 . 1 根瘤菌肥料: 能在豆科植物上形成根瘤( 或茎瘤) ， 同化空气中的氮气， 供应豆科植物的氮素营养。 用根瘤菌属( R h i z o b i u m) 或慢生根瘤菌属( B r a d y r h i z o b i u m ) 的菌株制造。 3 . 2 固 氮菌肥料: 在土壤和很多作物根际中同 化空气中的氮气， 供应作物氮素营养; 又能分泌激素刺激 作物生长。用下列菌种之一制造。 固氮菌属( A z o t o b a c t e r ) 氮单胞菌属( A z o m o n a s ) 固氮根瘤菌属( A z o r h i r o b i u m) 根际联合固氮菌: 固
3、 氮螺菌属( A z o s p i r i l l u m ) 阴沟肠杆菌( E n t e r o b a c t e r c l o a c e a ) 经鉴定为非致病菌 粪产碱菌( A l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) 经鉴定为非致病菌 肺炎克氏杆菌( K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 经鉴定为非致病菌 其他经过鉴定的用于固氮菌肥料生产的菌种。 这些菌主要特征是在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子态氮。 3 . 3 磷细菌肥料: 能把土壤中难溶性磷， 转化为作物可以利用的有效磷， 改善作物磷
4、素营养。用下列菌 种之一制造。 分解有机磷化合物的细菌: 解磷巨 大芽胞杆菌( B a c i l l u s m e g a t h e r i u m p h o s p h a t i c u m ) 解磷珊瑚红赛氏 杆菌( S e r r a t i a c a r o l l e r a p h o s p h a t i c u m ) 节杆菌属中的一些种( A r t h r o b a c t e r s p . ) 转化无机磷化合物的细菌: 中华人民共和国农业部1 9 9 4 一 0 5 一 1 3 批准 1 9 9 4 一 0 5 一 3 0 实施 N Y 2 2 7 一
5、9 4 假 单 胞 菌 属中 的 一 些 种( P s e u d o m o n a s s p . ) 其他经过鉴定的用于磷细菌肥料生产的菌种。 有机磷细菌在含磷矿粉或卵磷脂的合成培养基上有一定解磷作用， 在麦熬发酵液中都含刺激植物 生长的生长素物质 无机磷细菌具有溶解难溶性磷酸盐的作用。 I 4 硅酸盐细菌肥料: 能对土壤中云母， 长石等含钾的铝硅酸盐及磷灰石进行分解， 释放出 钾、 磷与其 他灰分元素， 改善作物的营养条件。 本品的生产菌种为胶质芽胞杆菌( B a c i l l u s m u c i l g i n o s u s ) 的菌株及 其他经过鉴定的用于硅酸盐细菌肥料生产
6、的菌种。 该菌在含钾长石粉的无氮培养基上有一定解钾作用， 菌体内和发酵液中存在刺激植物生长的生长 素物质。 I5 复合微生物肥料: 含有上述( 解磷、 解钾、 固氮微生物) 或其他经过鉴定的两种以上互不 拮抗微生 ， 通过其生命活动， 能增加作物营养供应量。 技术要求 4 门成品技术指标， 表 I 成品技术指标， ， 在产品标明的失效期前有效活菌数应符合指标要求， 出厂时产品有效活菌数必须高出本指标3 0 %以上 4 . 2 成品无害化指标 N Y 2 2 7 一 9 4 表 2 成品无害化指标 编号单位 标准限值 蛔虫卵死亡率 大肠杆菌值 9 5 - 1 0 0 匀邻蜘枷 汞及化合物( 以H
7、 g 计) 锡及化合物( 以C d 计) 铬及化合物( 以C r 计) 砷及化合物( 以A s 计) 铅及化合物( 以P b 计) mg / k g m g / k g mg / k g m g / k g mg / k g 10-10 5 5 检测方法 5 . 1 外观 感观检验符合4 . 1 成品技术指标。 5 . 2 有效活菌数和杂菌含量测定 5 . 2 . 1 试剂和溶液 a . 无菌水、 蒸馏水; b ， 选择培养基( 附录A ) ; c . 刚果红染液( 0 . 5 %) 0 5 . 2 . 2 仪器 a . 显微镜 1 o 0 o x; b摇床旋转式2 0 0 r / m i n
8、 ; c . 恒温培养箱; d . 恒温烘干箱; e灭菌锅; f ， 扭力天平( 分度值0 . 0 1 g ) ; S . 玻璃仪器( 灭菌的9 c m平皿、 1 0 m L , 5 m L , l m L吸管、 三角瓶、 玻璃刮刀) 。 5 . 2 - 3 测定步骤 5 . 2 . 3 . 1 采样应不少于5 0 0 g ， 从中 称取1 0 2 0 g ( 精确0 . 0 1 g ) ， 加入带玻璃珠的1 0 0 -2 0 0 m L的无 菌水中( 液体菌剂取1 0 2 0 m L ， 加入9 0 1 8 0 m L的无菌水中) ， 静置2 0 m i n 后在旋转式摇床上2 0 0 r
9、/ m i n 充分振荡3 0 m i n ， 即成母液的菌悬液。 5 . 2 . 3 . 2 用无菌吸管吸取5 m L上述母液的菌悬液加入4 5 m L 无菌水中， 混匀成1 : 1 0 稀释的菌悬 液， 这样依次稀释， 分别得到1 : 1 X1 叭 1 : 1 X1 0 “ 和 1 : 1 X1 0 , 1 : 1 X1 0 等浓度( 每个稀释度必须更 换无菌吸管) 。 5 . 2 . 3 . 3 用1 m L 无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0 . 1 m L ， 加至直径为9 c m平皿的琼脂培养基 表面， 用无菌玻璃刮刀将菌 悬液均匀地徐于琼脂表面。 或取1 m L不同稀释度菌悬液加
10、入培养皿内， 与 琼脂培养基混匀。 每个样品取3 个连续适宜稀释度， 每一稀释度重复3 次， 同时加无菌水的空白对照， 培 养2 - 5 d ， 每个稀释度取5 1 0 个菌落的菌体， 涂片染色， 显微镜观察识别后计数菌落。 5 . 2 . 4 计算公式: 统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。 根据式( 1 ) 和式( 2 ) 计算: N Y 2 2 7 一 9 4 菌剂含菌数 一 菌落平均数 x 母液菌悬液的体积 菌剂数 杂菌率( %)= 稀释倍数 x 杂菌数 有效菌数 十杂菌数 火 1 0 0 (2) 根据菌落特征判定， 分别计算出制品中的特定微生物及杂菌数率。 固 体( 包括颗粒)
11、菌剂含菌数以亿 / 9 表示， 液体菌剂含菌数以 亿/ m L 表示。 5 . 2 . 5 菌落计数 5 . 2 . 5 . 1 以平板上出现3 0 -3 0 0 个菌落数的稀释度平板为计数标准。 5 . 2 . 5 . 2 当只有一个稀释度， 其平均菌落数在 3 0 -3 0 0 之间时， 则以该平均菌落数乘以其稀释倍数( 见 表 3 例1 ) 0 5 . 2 . 53 若有两个稀释度， 其平均菌落数均在3 0 3 0 0 之间， 应按两者菌落总数之比 值来决定。 若其比 例小于2 应计数两者的平均数， 若大于2 则计数其中稀释较小的菌落总数( 见表3 例2 及例3 ) , 5 . 2 .
12、5 . 4 若三个稀释度的平均菌落数均大于3 0 0 ， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数( 见 表 3 例4 ) , 5 . 2 - 5 . 5 若三个稀释度的平均菌落数均小于3 0 ， 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数( 见表 3 例 5 ) , 5 . 2 - 5 . 6 若三个稀释度的平均菌落数均不在3 0 - 3 0 0 之间， 则以最接近3 0 0 或3 0 的平均菌落数乘以 稀释倍数( 见表3 例6 ) a 表 3 计算菌落总数方法的示例 例次 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度 菌落数之比 菌落总数 个/ . L或个/ H 1 0 - 1 0 - 1 0 - 1
13、 1 4 3 11 5 9 2 2 1 . 6 X1 0 2 2 7 6 02 3 5 3 1 1 . 3 2 . 7 X1 0 32 6 7 6 1 3 6 3 4 2 . 5 1 . 4 X1 0 4 无法计数1 1 4 23 1 2 3 . 1 X1 0 52 8 1 2 5 2 . 8 火1 0 , 6 无法计数3 0 31 8 3 . 0 X1 0 5 . 3 含水量测定 5 . 3 门仪器 a . 土壤铝盒; b . 扭力天平( 分度值。 . 0 1 g ) ; c恒温烘干箱; d干燥器。 5 . 3 . 2 测定步骤 称取样品3 0 - 4 0 g ( 精确到。 . 0 1 g
14、) 二份放人铝盒中， 于1 0 5 条件下烘烤 入干燥器内 冷却， 一般冷却2 0 m i n ， 再称其残重和铝盒重， 损失量即为水分含量 4 h 直至恒重， 取出后放 N Y 2 2 7 一 9 4 .(3) 533 汁算公式: 式中: 。 。 表示烘干前样品重， 9 ; m , 表示烘干后样品重， 9 。 5 . 4 p H值测定 5 . 4 . 1 试剂和溶液 无离子水 5 . 4 . 2 仪器 a烧杯; b ， 酸度计; c . 扭力天平( 分度值。 - 0 1 g ) , 5 . 4 . 3 测定步骤 H BO % 一 m 糯 尹 = X 1 0 0 随机称取样品8 g ， 将样品
15、置于干净烧杯内， 按1 : 2 加入无离子水， 浸泡振荡均匀。预热p H计， 用 标准溶液( p H 6 . 8 6 ) 校正仪器后， 测定样品悬液p H， 边测边搅拌， 仪器读数稳定后记录。 每个样品重复三 次 5 . 5 细度检验 5 . 5 . 1 仪器 扭力天平( 分度值。 . 0 1 g ) ; b . 标准筛孔径 0 . 1 8 m m孔径0 . 2 5 m m, 5 - 5 - 2 测定步骤 供检样 1 0 0 g ， 经过1 0 5 烘干1 h ， 过孔径0 . 1 8 m m标准筛， 筛下部分占检样重量)8 0 ， 其他部 分全部通过孔径0 . 2 5 m m筛， 即为合格。
16、 5 . 6 有机质测定 5 . 6 . 1 仪器 a . 瓷柑竭; b . 烘箱; c . 高温电炉; d . 干燥器; e . 扭力夭平( 分度值。 . 0 1 g ) , 5 . 6 . 2 测定步骤 采用灼烧减重法测定。 称取样品1 0 g , 置已称重的瓷柑锅中于6 0 C 烘箱中烘4 -6 h , 冷却称重 ( m。 ) 。然后在5 5 0. 6 0 0 高温电炉中 灼烧2 h ， 用增祸钳取至干燥器中， 放冷至室温， 称重( 二 ， ) 。 计算公式 ，.(4 有机质 。 。 表示柑塌加烘干样品重， 9 ; m , 表示增祸加灼烧后样品 重， 9 ; m表示风干后样品重， 9 。
17、 % m o - M , X 1 0 0。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 . ， 。 。 。 。 有毒物质( 重金属) 的测定 汞 ，J:1卜 已中7又41 5式55 N Y 2 2 7 一 9 4 按G B 7 4 6 8 操作 5 . 了 . 2 镐 按G B 7 4 7 1 操作。 5 ， 7 . 3 铬 按G B 7 4 6 6 操作。 5 . 7 . 4 砷 按G B 7 4 8 5 操作。 5 . 7 . 5 铅 按G B 7 4 7 0 操作。 58 蛔虫卵的测定 按G B 8 1 7 2 操作 5 . 9 大肠菌值的测定 按G
18、B 4 7 8 9 操作 6 检验规则 6 门 生产微生物肥料所使用的菌种， 须在本标准菌种规定范围 之内。 若使用规定之外的菌种 必须经过 国家级科研单位的鉴定， 包括菌种属及种的学名， 形态， 生理生化特性， 效力， 安全性等完整资料。 以杜绝 一切植物检疫对象， 传染病病源作为菌种生产的产品 6 . 2 本标准规定中的成品无害化指标和有效活菌数、 杂菌数及有效期， 是微生物肥料质量安全、 有效的 重要依据， 一切微生物肥料的产品必须达到的指标。成品无害化检验可委托省市以上环境监测机构进 行， 并提供检验证明。 有效活菌数、 杂菌数， 由 农业部指定检测机构检验。 本标准所规定的外观、 水
19、分、 细 度、 有机质和p H值等指标 作为微生物肥料质量检验参考指标. 6 . 3 复合微生物肥料， 是指两种以上微生物菌种的复合。不论使用何种微生物菌种、 几种菌种生产， 其 菌种必须符合本标准( 6 . 1 ) 规定。 而且有效活菌数: 液体型不得低于1 0 亿/ m L固体型不得低于2 亿/ g . 颗粒型不得低于1 亿/ 9 。 复合微生物肥料的成分中， 除主体微生物外， 含有其他基质成分的， 其基 质成分 应有利于 微生物肥料中的菌体生存， 绝不能降低或抑制菌体的存活。 因加基质成分过多、 不当， 微生物肥 料有效活菌数过低或有效活菌数测不出来的而不达标者， 则该产品不是微生物肥料
20、。 64 微生 物肥料应由 生产厂的技术检验部门进行检验， 生产厂应保证所有出厂的微生 物肥料都达到本 标准要求， 每批出厂的微生物肥料都应附有一定格式的质量合格证明。 6 . 5 微生物肥料按批检验， 以每一发酵罐生产的产品为一批。 6 . 6 取样方法， 随机抽样， 以箱或袋为抽样单位。每批固体菌剂抽样 5 - 1 0 箱。每箱中抽 1 袋， 无菌操 作取祥1 0 0 g , 混匀用四分法缩分到5 0 0 g ， 供检验用。 颗粒菌剂每批抽样5 或1 0 袋， 无菌 操作， 每袋取样 。5 k g ， 仔细混匀后， 用四分法缩分到5 0 0 g ， 以供检验用。 液体菌剂每批抽样5 或1
21、0 箱， 每箱抽1 瓶， 无菌操作， 每瓶吸取5 m L一同放入无菌的三角瓶中， 摇 均匀， 瓶上粘贴标签， 标明 产品名称、 取样日 期、 批号、 取样人， 以供检验用. G7 如果检验结果不符合标准规定时， 应以加倍数量按规定选取试样进行检验， 如仍不符合标准规定， 该批产品判为不合格。 7 包装、 标志、 运输与贮存 71 微生物肥料固 体菌剂内 包装材料用聚乙 爆薄膜袋， 外用纸箱包装。 液体菌剂小包装用玻璃质疫苗 瓶或塑料瓶， 外包装纸箱。颗粒菌剂用编织袋内衬塑料薄膜袋包装， 袋口须密封牢固。 72 包装箱( 袋) _ r . 应印有产品名称、 商标、 标准号、 生产许可证号、 生产
22、厂名、 厂址、 生产日 期、 有效期、 批号、 净重、 防晒、 防潮、 易碎、 防倒置等标记。 内包装袋上应印有产品名称、 商标、 标准号、 有效细菌含量， N Y 2 2 7 一 9 4 研制、 生产单位， 产品性能及使用说明。 7 . 3 每箱( 袋) 产品中附有产品合格证和使用说明书。 7 . 4 适用于常用运输工具， 运输过程中应有遮盖物， 防雨淋、 防日晒及 3 5 以上高温气温低于。 时 需用保温车( 8 -1 0 0c ) 运输。轻装轻卸， 避免破损 了 . 5 微生物肥料应贮存在常温、 阴凉、 干燥、 通风的库房内， 不得露天堆放， 以防雨淋和日晒， 防止长时 间3 5 以上高
23、温。码放高度毛1 3 0 c m N Y 2 2 7 一 9 4 附录A 有效活菌数测定的选择培养基 ( 补充件) 1 %N a , Mo O , 。 2 H, 0 1 0 o H, B O, 酵母膏1 . 0 g ( 或酵母粉0 . 8 g ) 。 ， 5 %刚果红 P H : m l.M L 059025哟 A l 根瘤菌培养基: K, HP 04 Mg S 04 7 H, 0 Na Cl C 6 H1 4 06 C a C O,1 0 g1 . 5 gm L0 A 2 固氮菌用阿须贝氏( A s h b y ) 培养基: K H, P 0 4 0 . 2 g Mg S 0 4 7 H 2
24、 0 0 . 2 g N a C I 0 . 2 g C a C O , C fi H1 4 06 C a S 04 2 H2 0 P H A 3 联合固氮菌培养基: ( 1 ) 培养基: 7 -C e H, 1 07 Na KH, P 04 K2 H P 04 Mg S 0 4 . 7 H , 0 酵母膏 5g 0 . 4 g 0 . 1 g 0 . 2 g 1 . 0 g Na Cl C a C l , F e C l , N a , Mo 04 2 H, 0 P H 0 . 1 g 0 . 0 2 g 0 . 0 1 g 0 . 0 0 2 g 6 . 8 - 7 . 0 瑰傀魄瑰 六n
25、nUn ( 2 ) 培养基: C , H, O, N a , K2 H P 0, K H2 P Oa Mg S 0 , 7 H , 0 Na Cl 5gC a C l , Na , Mo O, 2 H2 0 F e C l , B T B ( 0 . 5 g / L ) P H 0 . 0 2 g 0 . 0 0 2 g 0 . 0 1 g 5 mL 7 . 0 A 4 硅酸盐细菌培养基: C 1 2 H2 2 01 1 Mg S O 一 7 H , 0 C a C O, Na , HP O, F e C l , 玻璃粉 P H 2 . 0 g 0 . 0 0 5 g 1 . 0 g 7 .
26、0 999 OLa，土 亡Jon n 5 解磷细菌培养基: ( 1 ) 有机磷细菌培养基: C , R2 0fi H, O 1 0只( NH4 ) I S O 0. 5 g421 NY 2 2 7 一 9 4 3 g0 3 g 日O Na Cl Mg s o, 7 H , 0 Mn S O, 4 H O 卵磷脂 0 . 3 g 0 . 3 g 0 . 0 3 g 0 2只 KCl F e S O, 7 H2 0 C a C O, P H 5g 7 . 0 - 7 . 5 ( 2 ) 无机磷细菌培养基: C , H z Os 。 H, O Na CI Mg S O , 7H,0 Mn S O 4
27、 H( ) ( NH, ) 2 S O, KCl F e S O, 7 H O C a , ( P O, ) , P H 0 . 59 0 . 3 g 0 . 0 3 g 5g 7 . 0 7 . 5 9瑰3903 0 1上000 A 6 马丁培养基( 测霉菌数) K HI P 0, 1 . 0 g Mg S O , 7 H 2 0 0 . 5 g 1 %孟加拉红水溶液 3 . 3 mL C , H z Os HB O 蛋白陈 1 0 . 0 g 5 . 0 g A 了 放线菌培养基( 改良高氏1 号) KN O, 1 . 0 g KH 2 P O, 0 . 5 g F e S O, 7 H,
28、 O 0 . 0 1 g 可溶性淀粉( 先加少量冷水调成糊状加 2 0 . 0 g 入 ) Mg 5 0 7 H , O Na CI: ， : : p H7 . 2 7 . 4 临用时在已融化的高氏1 号培养基中加入重铬酸钾溶液， 以抑制细菌和霉菌生长。 每3 0 0 m L培养 基中 加3 % 重铬酸钾1 m L ( 1 0 0 m g / k g ) . 注: 以上各培养基均需加入蒸馏水1 0 0 0 m L . 琼脂1 8 2 0 g . A 8 刚果红染液( 。 . 5 %) 刚果红( C o n g o r e d ) 0 . 5 g 蒸馏水1 0 0 mL 附加说明: 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由农业部中国农科院土肥所负责起草。 本标准主要起草人李元芳、 宁国赞。