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1、N Y 4 1 3 -2 0 0 0 前言 本标准在原有标准N Y / T 2 2 7 -1 9 9 4 ( 微生物肥料 的基础上. 对其中的硅酸盐细菌肥料部分进行 修改 主要修改内容如下: 一 增加术语、 抽样和判定规则部分。在检验方法中增加允许差; 在技术要求中删除成品无害化指标。 本标准自生效之日起， 同时代替N Y/ T 2 2 7 -1 9 9 4中的硅酸盐细菌肥料部分。 本标准的附录A、 附录B 、 附录C都是标准的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位: 农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、 中国农业科学院土壤肥料研究所 本标准主要起if人: 李慧荃、 昊观
2、以、 李元芳、 葛诚、 沈德龙。 中华人民共和国农业行业标准 硅酸盐细菌肥料 S i l i c a t e b a c t e r i a f e r t i l i z e r N Y 4 1 3 -2 0 0 0 1 范围 本标准规定了 硅酸盐细菌肥料产品的分类、 技术要求、 试验方法、 检验规则、 包装、 标识、 运输与贮 存。 本标准适用于能释放钾、 磷与灰分元素， 改善作物营养条件的有益微生物发酵制成的活体微生物肥 料制 品。 2 引用标准 下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均 为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探
3、讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 1 2 5 0 -1 9 8 9 极限数值的表示方法和判定方法 G B / T 6 5 4 3 一 1 9 9 6 瓦楞纸箱 NY 4 1 1 -2 0 0 0 固氮菌肥料 N Y / T 2 2 7 -1 9 9 4 微生物肥料 3 定义 本标准采用下列定义。 3 门硅酸盐细菌肥料 在土壤中通过其生命活动， 增加植物营养元素的供应量， 刺激作物生长， 抑制有害微生物活动， 有一 定的增产效果。 4 产品分类 按剂型不同分为: 液体菌剂、 固体菌剂和颗粒菌剂 5 技术要求 5 . 1 菌种 非致病菌， 能在含钾的长石粉、 云母及其他矿石的无氮培
4、养基上生长， 菌体内和发酵液中存在钾及 刺激植物生长的激素物质。 5 . 1 . 1 菌种用胶冻样芽胞杆菌( B a c i l l u s m u c i l a g i n o s u s ) 的一个变种菌株或环状芽胞杆菌( B . c i r u l a n s ) 及其他经过鉴定用于硅酸盐细菌肥料生产的菌种， 严格控制各种遗传工程微生物菌种( G E M) 的使用 凡用本标准以外的菌种必须经过鉴定。 5 . 1 . 2 菌体大小为4 -7 k m X1 -1 . 2 1 a m， 长杆状， 两端钝圆， 胞内常有1 -2 个大脂肪颗粒， 革兰氏染 色呈阴性， 有荚膜， 有椭圆形芽胞 中华
5、人民共和国农业部2 0 0 0 - 1 2 - 2 2批准 2 0 0 1 一 0 4 一 0 1实施 N Y 4 1 3 -2 0 0 0 石无氮培养-y : 卜 生长的菌落粘稠， 富有弹性. 呈圆形， 边缘整齐、 光滑、 有光泽， 隆起度大， 无色透 在牛肉膏蛋白陈培养基 L 基本不生长。 成品技术指标( 见表 功 表 t 成品技术指标 513明51452一 液体固体颗粒 无异臭味 黑褐色或褐色粉状， 松散， 无异臭味 湿 润 一黑 色 或 。 色 颗 粒 水分. x 1 , 11值 细度筛余物， % 孔径 0 . 1 8mrn 孔径 5 . Om m- 2 . smm 有效期内有效 活菌
6、数 1 0 e / m L ( g ) 杂菌率 ) ， %琪 有效期朴 ， 月) 2 0. 0 S o ( )2 0 % ， 样品通过0 . 1 8 筛余物干重 十 m m孔径筛子的百分数按式( 3 ) 计算: ( 1一样品含水百分数) 样品质量 X 1 0 0 ( 2) 样品通过。 . 1 8 m。孔径筛子的百分数二I 一筛上样品百分数 ， ， ( 3) 颗粒样品通过筛子测量时， 不须水浸泡， 将孔径5 . 0 m m和25 m m两筛攘在一起， 大孔径在上， 一 次通过。筛上物须 tt / v ) 碱性复红。 . 5 0 g 9 5 %酒精1 0 0 . 0 mL A 2 菌体染色方法 取
7、一小滴无菌水于干净的载玻片上， 用接种环蘸取少许菌苔或菌液， 与水混合涂成均匀的薄层， 在 空气中自 然干燥。 手持载玻片一端迅速通过酒精灯火焰2 - - 3 次固定。 加石碳酸复红或美兰染色液一滴， 染色约 1 m i n ， 用自 来水轻轻冲洗染料， 用吸水纸吸净玻片多余的水， 干燥、 镜检。 A3 英膜染色方法 制片同A2 。石碳酸复红染1 m i n后， 水洗， 用吸水纸吸去水分， 自然风干， 在载玻片一端加一滴墨 汁， 用吸水纸推向另一端， 涂布成一薄层， 干燥后镜检。染色结果， 背景黑色， 菌体红色， 菌体外包一层透 明圈， 即为荚膜。 也可以加石碳酸复红染色1 m i n ， 水
8、洗， 干燥后镜检。 染色结果， 菌体红色， 包围一层不 着色的部分就是荚膜 A 4 芽胞染色方法 制片同A 2 。 加孔雀绿染色液3 -5 滴于涂片上， 酒精灯火焰加热至冒气， 但不沸腾， 并随时补加染色 液， 维持涂片处不干， 染色约5 1 0 m i n ， 自 来水冲洗3 0 s 。 用。 . 0 5 %碱性复红或。5 %番红染色1 m i n , 水洗， 镜检。染色结果， 芽胞绿色， 菌体红色。 N Y 4 1 3 -2 0 0 0 革兰 氏染 色法 1 染色剂 1 . 1 结晶紫染色液 : 尸口J二 AAA 甲液: 结晶紫2 . 0 9 9 5 %酒精2 0 mL 乙液: 草酸钱0
9、. 8 0 g 蒸馏水8 0 m L 甲、 乙液相混， 静置4 8 h后使用。 A 5 . 1 . 2 卢哥( L u g o l ) 氏碘液 碘( 1 , ) 片1 . 0 g 碘化钾( K I ) 2 . 0 g 蒸馏水3 0 0 m L 先取少量( 3 -5 mL ) 蒸馏水溶解碘化钾， 再投入碘片， 待碘全溶后， 加水 1 0 0 m L， 配成母液， 使用时 加2 倍水， 稀释成卢哥氏碘液。 A 5 . 1 - 3 脱色剂: 9 5 %酒精。 A 5 . 1 - 4 复染液: 0 . 5 %番红水溶液。 2 . 5 %番红酒精溶液2 0 mL 蒸馏水8 0 mL A 5 . 2 染色
10、方法 A 5 . 2 门制片。 A 5 . 2 . 2 滴加结晶紫液， 覆盖1 m i n e A 5 . 2 . 3 用水冲净结晶紫， 风干( 或吹干) 。 A 5 . 2 - 4 滴加碘液， 覆盖1 m i n , A 5 . 2 . 5 用水冲去碘液， 用吸水纸吸去水分， 风干( 吹干) 。 A 5 . 2 . 6 加9 5 %酒精数滴， 并轻轻摇动进行脱色， 3 0 s 后水洗， 吸去水分， 风干( 或吹干) 。 A 5 . 2 - 7 番红染色液染色 1 -2 ( 或更长) m i n 后， 自来水冲洗。干燥、 镜检 A 5 . 3 染色结果 革兰氏阳性菌体呈紫色， 阴性菌体呈红色。
11、 附录B ( 标准的附录) 有效活菌数和杂菌含t测定用培养基 s 1 硅酸盐细菌有效活菌数测定的培养基配方 蔗糖 磷酸氢二钠( N a 2 H P O , ) 硫酸镁( Mg S 0 4 . 7 H2 0) 碳酸钙( C a C O, ) 氯化铁( F e C I , ) 玻璃粉 蒸馏水 琼脂 p H 5 . 0g 2 . 0 g 0 . 5 g 0 . 1 g 0 . 0 0 5 g 1 . 0 g 1 0 0 0 mL 1 8 2 0 g 7 . 0 NY 4 1 3 - -2 0 0 0 B 2 马丁培养基( 测霉菌数) 磷酸二氢钾( K H , P O , ) 1 . 0 g 硫酸镁(
12、 Mg S 0 , 7 H , O ) 0 . 5 g 葡萄糖( C , H: ( ) H ., O ) 1 0 . 0 g 蛋白脉5 . 0 9 1 %孟加拉红酒精 无水) 溶液33m l - 琼脂1 8 -2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 M L 临用时每1 0 0 m 工培养基中加1 %的链霉素溶液0 . 3 m L ( 3 0 m g / k g ) ， 或每1 0 0 0 m l ， 培养基中加人 。1 g 氯霉素共同灭菌。 附录C ( 标准的附录) 硅酸盐细菌发醉液中全钾含t测定方法一 一 火焰光度法 C原理 火焰光度计是测量某种待测元素通过火焰激发出光谱能量强度的仪器。 将样品制
13、备成简单的溶液， 用压缩空气使溶液喷成雾状， 与乙炔或其他可燃气体混合后燃烧。溶液中的钾、 钠等离子则发出其特殊 的发射明线光谱， 用滤光板分离选择后， 由光电池把火焰发出的光能变成光电流， 再由检流计量出电流 大小。 光电流的大小与溶液里该元索的 含量是呈正相关的， 再从同 样条件下测定的标准溶液所作的曲线 卜 查出相对应的浓度而定量。 C 2 盆化钾标准曲线的绘制 准确称取经1 0 5 - c . 烘干4 -6 h 的分析纯氯化钾1 . 5 8 3 0 g . 溶于蒸馏水中， 定容至1 0 0 0 m L 摇匀， R P 为1 0 0 0 m g / k g 氧化钾基准溶液， 将此溶液稀释
14、成1 0 0 m g / k g , 用其配制2 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , 1 5 , 2 0 m g / k g 氧化钾标准溶液系列各5 0 m L ( 或2 5 0 m l . ) ， 用火焰光度计测定出电流读数。 在方格纸上以电流计读数 为纵坐标， 以氧化钾浓度为横坐标. 绘成标准曲线 C 3 测定步骤 培养液成分是: 葡萄糖( C , H , , 0 , 。 H i 0 ) 5 . 0 g , 硫酸镁( Mg S O , 7 H , 0 ) 0 . 5 g , 碳酸钙( C a c 0 3 ) 0 . 1 g磷酸氢二钠( N a , H P O , ) 4 2 . 0 g
15、 , 氯化铁( F e C l , ) 0 . 0 0 5 g ， 钾长石粉( 玻璃粉、 含钾的矿石粉) 1 . 0 g , 蒸馏水1 0 0 0 m L , p H 7 . 0 。 将上述培养液1 0 0 m L 装2 5 0 m L三角瓶中， 1 2 1 灭菌3 0 m i n 。 冷却后接种 硅酸盐细菌菌悬液。 在2 8 C 2 0 0 r / m i n 摇床培养4 d 后， 将培养物全部转移至蒸发皿中， 在水浴上浓缩到 1 0 m l ， 左右， 加入 %( V / V ) H 必: 少许， 继续蒸煮， 同时不断搅动， 如此反复 处理. 直到硅酸盐细菌粘液 消失为止。 加水过滤到1 0 0 m L 容量瓶中， 定容后， 用火焰光度计 进行钾的测定。 根据电流读数， 在标准 曲 线上即可查出 硅酸盐细菌解钾( K , O ) 数。 结果表示， 每1 0 0 m L 发酵液含氧化钾( K , 0 ) 的数量以m g / k g 表示。数值保留小数点后两位。