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1、进口动物源性 饲料中牛羊源性成分 检测方法 PCR 方法 Identification of bovine，sheep and goat derived materials in import animal derived feedstuff PCR method SNT 11192002 前 言 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国进出口商品检验技术研究所、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民 共和国珠海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：徐宝梁、杨宝华、王静、曹际娟、薄清如。
2、 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 引 言 牛海绵状脑病、痒病均可通过食用病畜组织传播，所以含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用，一直被认为是牛海绵状脑病、痒病得以传播的主 要途径。禁止疫区含牛羊源性成分的动物源性饲料的生产、流通和使用，也就成为防止牛海绵状脑病、痒病感染、流行的主要手段。 根据牛羊遗传物质的特异性，应用PCR方法，可以检测动物源性饲料中牛羊源性成分。本方法的测定低限为0.125。 1 范围 本标准规定了进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测的抽样、制样、PCR方法、限制性内切酶酶切反应方法。 本标准适用于动物源性饲料中牛羊源性成分的定性检测。 2 术语、定义和缩略语 下列
3、术语、定义和缩略语适用于本标准。 2.1 动物源性饲料 animal derived feedstuff 含有动物成分的饲料。 2.2 牛源性成分 bovine derived material 牛特异性DNA片段。 2.3 羊源性成分 sheep and goat derived material 羊特异性DNA片段。 2.4 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，简称PCR。使用两段(20个24个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可 和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液由包
4、括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸(dNTP)、模板DNA及引物。在DNA聚 合酶催化下，通过温度的变化(DNA变性、退火及延伸)而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以 扩增。经25个30个循环，扩增倍数达10。、 2.5 缩略语 PCR：polymerase chain reaction，简称PCR。 DNA：deoxyri60nucleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。 dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三
5、磷酸。 dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 dTTP：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸。 dUTP：deoxyuridine triphosphate，脱氧尿苷三磷酸。 UDG：uracil DNA glycosylase，尿嘧啶DNA-糖基酶。 bp：base pair，碱基对。 BSA：bovine serum albumin，牛血清白蛋白。 EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺
6、四乙酸。 Taq：Thermus aquaticu，水生栖热菌。 Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷。 TE：Tris-CI、EDTA缓冲液。 GuSCN：guanidinium isothiocyanate，异硫氰酸胍。 Triton X-100：t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇。 3 抽样和制样 3.1 检验批 以不超过200 t为一检验批，简称批。 同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等级。 3.2 抽样数量 3.2.1 袋装饲料 按式(1)计算抽样袋数
7、： (1) 式中： N全批袋数； a抽样袋数。 注: a值取整数，小数部分向前进位为整数。 3.2.2 散装饲料 根据散装单位的大小和类型，一般可从上、中、下三层的中心及四角五点抽样；或分层随机采样，取样点不少于15处。 3.3 抽样工具 3.3.1 金属单管抽样器：全长65 cm75 cm，槽口长50 cm55 cm，口宽l cm1.8 cm，头尖形，最大外径约2.5 cm，或其他等效抽样器。 3.3.2 取样铲。 3.3.3 分样器。 3.3.4 样品袋t可密封。 3.4 抽样方法 3.4.1 袋装饲料 将扦槽向下，从每袋一角依斜对角方向插入袋内，然后将扦槽旋转向上，抽出扦样器。每袋取样量
8、不少于500 g。 每批所抽取的样品总量不少于4 kg。 3.4.2 救装饲料 分层定点采样，每点取样量不少于500 g。 每批所抽取的样品总量不少于4 kg。 3.4.3 实验童样品制备 合并所取样品，充分混匀，用分样器或按四分法缩样，至样品重约1 000 g。装入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。 3.5 试样制备 从所取实验室样品中取出有代表性样品约500 g，经粉碎机粉碎，过20目筛，混匀，均分成三份。分别装入清洁容器内，加封后，标明标记。 3.6 试样保存 试样于4下避光保存。 4 测定方法 4.1 方法提要 利用裂解液破碎细胞，二氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA，
9、以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；应用限 制性内切酶酶切反应进行确证。 4.2 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。 4.2.1 引物 4.2.1.1 牛源性成分检测用引物(对)序列为： 5-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3 5-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3 4.2.1.2羊源性成分检测用引物(对)序列为： 5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3 5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3 4.2.2 Taq DNA聚合酶。 4.2.3 限制性内切酶：Dpn、sau3A I
10、。 4.2.4 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 4.2.5 琼脂糖：电泳纯。 4.2.6 澳化乙锭。 4.2.7 三氯甲烷。 4.2.8 异丙醇。 4.2.9 70乙醇。 4.2.10 分子量标记：50 bp300 bp。 4.2.11 裂解液：5 molL GuSCN，0.05 molL Tris-盐酸(pH6.4)，0.02 molL EDTA(pH8.0)，1.3Triton X-100。 4.2.12 TE缓冲液：10 mmolL Tris-盐酸(pH8.0)，1 mmolL EDTA(pH8.0)。 4.2.13 10PCR缓冲液：100 mmolL氯化钾，160
11、 mmolL硫酸铵，20 mmolL硫酸镁，200 mmolLtris-盐酸(pH8.8)，1Triton X-100，1 mg mlBSA。 4.2.14 电泳缓冲液：Tris 54 g，硼酸27.5 g，0.5 molL EDTA(pH8.0)20 mL，加蒸馏水至1 000 mL，使用时10倍稀释。 4.2.15 加样缓冲液：0.25溴酚蓝，40蔗糖。 4.2.16 酶切缓冲液：10 mmolL Tris-HCl(pH7.5)，10 mmolL氯化镁，50 mmolL氯化钠，0.1 mgmL BSA。 4.3 仪器和设备 4.3.1 粉碎机。 4.3.2 离心机。 4.3.3 DNA热循
12、环仪。 4.3.4 电泳仪。 4.3.5 pH计。 4.3.6 移液器：10L、20 L、100L、1 000 L。 4.3.7 紫外检测仪。 4.3.8 恒温水浴锅。 4.4 步骤 4.4.1 模板DNA提取 称取50 mg试料于1.5 mL离心管中，加入200L TE，混匀；加入.400L裂解液，加400 L三氯甲烷，混匀；10 000 rmin离心5 min，取上清 液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10 000 rmin离心5 min，弃上清液；70乙醇洗涤一次，晾干；加入50L TE，溶解沉淀。 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 4.4.2 PCR扩增 反应体系体积为50 L
13、：10PCR缓冲液5L、dNTP(5 mmolL)1L、引物对(各5 molL)2L、Taq DNA聚合酶(5 UL)0.5 L、模板DNA(0.1 g1.0 g)10 L、水31.5 L。反应条件：94预变性1 min3 min。94变性30 s60 s，5658退火30 s60 s，72延伸30 s60 s， 30个循环。72延伸5 min。4保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用牛源性饲料或羊源性饲料作阳性对照，用非牛源性饲料或非羊源性饲料作阴性对照，空白 对照除不加模板外，测定步骤相同。 4.4.3 PCR扩增产物电泳检测 取1.5 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液
14、中加热，充分溶化，加入澳化乙锭至终浓度为lgmL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没 过凝胶。将5 L8L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9 Vcm恒压，电泳10 min20 min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 4.4.4 确证试验 4.4.4.1 限翻性内切一奠切反应 PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。 Dpn反应体系(50L)：Dpn酶(5 UL)2L，酶切缓冲液5L，PCR扩增产物20L，水23L。Sau3 A I反应体系(50L)：Sau3 A I酶(10 UL) 1L，酶切缓冲液5L，PCR扩增产物20L，水24L。充分混匀反应
15、液，37温浴1 h，65水浴5 min终止酶切反应。取2 g3 g琼脂糖，其余同 4.4.3，进行限制性内切酶酶切产物电泳检测。 4.4.4.2 PCR扩增产物测序 必要时，进行PCR扩增产物测序，具体步骤见附录A。 5 结果及判 断 5.1 PCR扩增产曲电泳检测结果 牛源性成分的PCR扩增产物为271 bp，羊源性成分的PCR扩增产物为294 bp。 5.2 限翻性内切t一切产物电泳检测结果 牛源性成分的PCR扩增产物Dpn限制性酶切产物为57 bp、214 bp。羊源性成分的PCR扩增产物Sau3 A I限制性酶切产物，绵羊为91 bp、203 bp，山羊为92 bp、202 bp。 5
16、.3 结果裹述 PCR扩增产物电泳检测结果阴性，未检出牛或羊源性成分。 PCR扩增产物电泳检测结果阳性，限制性内切酶酶切产物片段大小正确，检出牛或羊源性成分。 6 废弃物处理和防止 污染的措施 检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 检测过程中防止交叉污染的措施见附录B。 附 录A (规范性附录) 确证试验 一PCR扩增产物测序 A.1 试剂和仪器 A.1.1 PCR扩增产物纯化试剂盒。 A.1.2 DNA测序试剂。 A.1.3 95乙醇。 A.1.4 甲酰胺。 A.1.5 DNA序列分析仪。 A.2 步骤 A.2.1 PCR扩增产物的纯化 按PCR扩增产物纯化试剂盒要求纯化，或直接测
17、序扩增。 A.2.2 测序扩增反应 反应体系(20L):8L DNA测序试剂，200 ng500 ng PCR纯化产物，3.2 pmol引物，水补足至20L；PCR扩增程序:96 10 s，50 5 s，60 4 min，25个循环，扩增产物4保存。 A.2.3 测序扩增产物的纯化 扩增管中加入16 pL水、64L 95乙醇，稍混匀，室温放置15 min，12 000 rmin离心20 min，去上清，加入250L 70乙醇，短暂混匀，12 000 rmin离心10 min，去上清，室温干燥。 A.2.4 测序 纯化产物管中加入170L甲酰胺溶液，95，5 min，迅速转移至冰上，2 min。
18、分装样品于测序仪的加样槽中，自动测序。 A.3 PCR扩增产物测序结果 A.3.1 牛源性成分的PCR扩增产物序列 gtaggcttgggaatagtacgataagggctacgagagggagacctaaaattacaggggtaataaaagaggtaaataaattttcgttcattttg tttctcaaggggtgttttgttttaatatttttgttggtgtcagttctggattgtgataaaggttgtgttttgaaacttttagttgaaagatgataa aaagggtcaagaatattgataagatcattgtcagtcatgttgacgtgtctag
19、ttgcggcatgtcaccaaggagagtatatggc A.3.2 羊源性成分的PCR扩增产物序列 A.3.2.1 绵羊 ccctgctcataagggaatagccatgcctaggtttattgatagttgtgtagttggtgtaaatgagtggggtaggaggcctagtaggtttgtagat ccaataaataaaattagggacattagtattaatagctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatttgttttgatactaattgaagtattc actgttggagggagatgaggcaggttgttgactagtcggct
20、tgatgtgggaaataataggctagggaataaaacaatgagggtaacaaggg ggaggcctaata A.3.2.2 山羊 ccctgctcataagggaatagcccatgcctagatttattgatagttgtgtagttggtgtaaatgagtggggtagaaggcctaataggtttgtaga tccaataaataggattagggacattaatattaatgttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatttgttttgatatgagttgaagtgccc attgttggagagagacgaggcggttgttaat
21、tagtcggtttgatgagggaaatagtaagctaggaaataaaataataagggtaacaagggg gaggCCtaata 附 录B (规范性附录) 检测过程中防止交叉 污染的措施 B.1 抽样和制样过程 抽样和制样工具，必须清洗干净，121、15 min20 min高压，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为 一次性灭菌容器。 B.2 检测过程 B.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进 行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单
22、方向进行。 B.2.2 实验过程中，必须穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。 B.2.3 各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用t不得带出该区。 B.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要121、15 min20min赢压，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液必须使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。 在2025储存的试捐中，可加入0.025的叠氮钠所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。 B.2.5 装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。 B.2.6 前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入
23、PCR反应各组分。 B.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。 B.2.8 可使用UDG和dUTP系统控制污染。 B.2.9 应遵循PCR操作的其他要求。 参考文献 1Tartaglia，M.，Saulle，E.，et a1.(1998).Detection of Bovine Mitochondrial DNA in Ruminant Feeds：A Molecular Approach to Test for the Presence of Bovine-Drived Materials.Journal of Food Protection，61：513518. 2Wang，R.G.，Myers，M.J.，et a1.(2000).A Rapid Method for PCR Detection of Bovine Mete rials in Animal Feedstuffs.Molecular and Probes，14：15. 3C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒(著).黄培堂，俞炜源等(译).PCR技术实验指南.科学出版社，1998，140.