《[商检标准]-SNT 1151.1-2002 对虾Taura综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[商检标准]-SNT 1151.1-2002 对虾Taura综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 1 5 1 .1 一 20 0 2 对虾 T a u r a 综合征病毒( T s v) 逆转 录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 诊断方法 T e s t me t h o d o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n ( R T - P C R) f o r t u a r a s y n d r o me v i r u s ( T S V) 2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布
2、2 0 0 3 一 0 5 一 01实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N/ T 1 1 51 .1 -2 0 0 2 目q台 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 江育林、 高隆英、 刘鱿、 史秀杰。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N/ T 1 1 51 . 1 -2 0 0 2 对虾T a u r a 综合征病毒( T S V ) 逆转录聚合酶链式反应( R T - P C R) 诊断方法 范 围 本标准规定了用聚合酶
3、链式反应技术检测对虾T a u r a 综合征病毒的方法。 本标准适用于对虾T a u r a 综合征病毒的鉴定及本病的流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件 其随后所有 的修改单( 不包括 勘误的内 容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根 据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 GB / T 6 6 8 2 -1 9 9 2分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) 3
4、 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3 .5 3. 6 试 剂和材料 水 应符合 G B / T 6 6 8 Z -1 9 9 2中一级水的规格。 Ta q酶 -2 0 保存 不要反复冻融或温度剧烈变化。 逆转录酶A MV -2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化。 R N A抑制剂又 R N a s i n ) 一 2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化。 d N T P 含d C T P , d G T P , d A T P , d T T P 各 1 0 mm o l / L ) 引物 浓度为4 0 p m o l / I 。 其序列如下: 上游引物 T S VF : S
5、 - T C A A T G AG A G C T T G G T C C - 3 下游引物 TS VR: 5 一 AAG丁AG ACA GC C GCG CT丁一 3 异丙醇 分析纯， 使用前预冷到一2 0 “C, 矿物油 要求无 D N A酶和 R NA酶。 剪刀、 镊子 器材和设备 P C R扩增仪 电泳 仪 微量移液器及吸头 紫外观察灯 恒温培养箱 普通冰箱和低温冰箱 ，尹口UO户 工JQ以qJ月马 4.1 4 . 2 4. 3 4. 4 4 . 5 4. 6 S N/ T 1 1 5 1 . 1 -2 0 0 2 4 . 7 电动匀浆器 4 . 8 离心机和离心管 5 T a u r
6、 a综合征病毒核酸的鉴定 5 1 采样 取活虾， 或取头部放在9 5 %的 酒精中( 可以在常温下保存3 0 d ) ， 但样品 处理前须让酒精完全挥发。 取约 5 0 mg -1 0 0 mg的鳃丝( 或者附肢、 上皮、 血淋巴) ， 放在 1 . 5 m L的离心管中。 5 . 2 样品处理 应在1 0 以 下进行 先加人1 5 0 p L C T A B ( 见附录A . 1 ) 溶液， 用小剪刀剪碎后， 用电 搅拌器将样 品匀浆成糊状。再加 C T A B溶液到 9 0 0 p L ,混匀后于 2 5 作用 2h 5 . 3 R N A抽提 在含有样品的离心管中加人6 0 0 p L
7、抽提液1 ( 见附录A . 2 ) ， 充分混匀 3 0 s , 1 2 0 0 0 r / m in 离心 5 m i n ， 取一层水相( 约7 5 0 p L ) 。再加人6 5 0 p L 抽提液2 ( 见附录A . 3 ) ， 充分混匀3 0 s , 1 2 0 0 0 r / m i n 离 心5 m i n ， 取上 层水 相( 约6 0 0 p L ) 。 再加人1 . 5 倍体 积的异丙醇( 约9 0 0 川一 ) ， 倒置数次 混匀后， - 2 0 C , 8 h 以上以 沉淀核酸， 1 2 0 0 0 r / m i n 离心3 0 s ， 弃去上清， 干燥后加 1 0
8、p L无菌蒸馏水溶解， 用作P C R 模板 。 5 . 4 变性和退火 在P C R管中加人1 0 p L 模板和5 p L 引物( 上游引物和下 游引物各2 . 5 p L ) ， 置于7 0 反 应5 m i n , 立即冰浴， 低速离心约 5s 使液体集中在底部。 5 . 5 c D N A合成 在上述反应管中继续加人d N T P 2 P L , 5 倍逆转录酶缓冲液( 见附录 A . 6 ) 5 I L , R N A抑制剂 ( 2 0 U ) 0 . 5 p L 、 无菌蒸馏水1 . 5 p L ， 再覆盖5 0 p L 矿物油。 将P C R管置于P C R 扩增仪中， 3 7
9、 C 反应1 0 m i n 后， 再加人1 p L逆转录酶A M V ( 2 0 U ) 并低速 离 心。4 2 C 6 0 mi n 反应以扩增出模板的 c D N A。反应结束后， 7 0 C 1 0 mi 。 灭活逆转录酶， 立即冰浴。 5 . 6 P C R扩增 D N A 在上述反应管中再继续加人T a q 酶S U, d N T P 1 p L ， 反向引物和正向引物各1 p L , 2 5 m m o l / L的 氯化镁( M g c l, ) ( 见附录A . 7 ) 1 0 p L , 1 0 倍 T a q 酶浓缩缓冲液( 见附录A , 8 ) 1 0 p L 、 加水
10、到总体积 1 0 0 p L , 混匀后低速离心， 让矿物油在上层。再将反应管置于 P C R扩增仪。先 9 4 C 4 m i n -5 0 C 1 mi n - 7 2 C 1 min ， 再9 4 C 1 m i n -5 0 -C 1 m i n -7 Z C 1 mi n , 3 5次循环， 然后7 Z C 5 mi n ， 最后4 C保温。 57 设立对照 5 . 7 . 1 在6 . 1 中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、 阴性样品对照、 空白对照。 5 . 7 . 2 取含有已知 T a u r a 病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。 5 . 7 . 3 取正常的细胞悬液
11、作为阴性对照。 5 , 7 . 4 取等体积的水代替模板作为空白对照。 5 . 8 琼脂糖电泳 用T B E ( 见附录A . 4 ) 电泳缓冲 液配制2 %的琼脂糖( 含。 . 5 p L / m L E B . 见附录A . 5 ) 平板。将平板 放人水平电 泳槽， 使电泳 缓冲液刚好淹没 胶面。 将6 p L 样品和2 I L 样品缓冲液( 见附录A . 9 ) 混匀后 加入样品孔 在电泳时设 立 D N A标准分子量Ma r k e : 作对照， 推荐使用p U C 1 9 D N A / M s p l ( H p a l l ) . 5 V / c m电泳约。5 h , 当澳酚蓝到
12、达底部时停止。 6. 1 6 .2 6. 3 6. 4 结果判 定 在紫外灯下观察核酸带并判断结果。 P C R后阳性对照会出现一条 2 1 3如 的DN A片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带 待测样品电泳后在相应 2 1 3 b y D N A位置上有带者为阳性。 无带或带的大小不是2 1 3 b y的为阴性。 S N/ T 1 1 5 1 .1 -2 0 0 2 附录A ( 资料性附录) 试荆配制 A. 1 CT AB溶液 按2 0 o C T A B , 1 . 4 m o l / L 抓化钠( N a C D , 2 0 m m o l / L E D T A , 2 0 m m o
13、 l / l . T r i s - H C I p H 7 . 5 配制。 用前加。 . 2 5 疏基乙醇。 A . 2 抽提液 1 酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇: 用 1 mo l / L T r i s 水溶液饱和的酚 ， 三氯甲烷 ， 异戊醇=2 5; 2 4“ 1 混合， 密 闭避光保存。 A . 3 抽提液 2 三氯甲烷/ 异戊醇: 将二者按 2 4 “ 1的比例混合， 密闭避光保存。 A . 4 T B E电泳缓冲液 5 倍浓缩液) T r i s 5 4 . 0 g 硼酸2 7 . 5 g E DTA 2 . 9 g 加水到1 0 0 0 mL 用5 mo l / L的盐酸( HC
14、 D 调到p H8 . 0 , A . 5 E B ( 核酸染色剂) 用水配制成1 0 m g / m 工 的浓缩液。 用时每1 0 m l 电泳液或琼脂中加1 川。 A . 6 逆转录酶的 5 倍浓缩缓冲液 Tr i s - HCI 氯化钾( K C D 氯 化镁( M g c l , ) DTT 2 5 0 m mo l / L p H 8 . 3 3 7 5 mmo l / L 1 5 mmo l / L 5 0 mmo l / L A . 7 氮化镁( Mg C 1 2 ) 2 5 m mo l / L A . 8 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液 Tr i s - HCI 氯化钾( K C D Tr i t onX- 1 00 5 0 0 m mo l / L p H 8 . 8 5 0 0 mmo l/ L 1 % A 9样品缓冲液 每 1 0 0 m 工溶液中含: 澳酚蓝 0 . 2 5 g ， 蔗糖 4 0 g ,