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1、牛Q热微量补体结合试验操作规程 Procedure of micro complement fixation test for bovine Q fever SN/T 1087 2002 前 言 本标准按照GB/T 1.1 1993标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定的要求，对原中华人民共和国 进出境动物检疫规程手册(1997年12月)中的“ 牛Q热微量补体结合试验” 进行修订。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、广州出入境检验检疫局。 本标准主要起
2、草人：柯忠哲、朱世强、林志雄、张立怀、范华炜。 本标准系首次发表的检验检疫行业标准。 1范围 本标准规定了牛Q热微量补体结合试验的操作技术要求。 本标准适用于牛、羊Q热微量补体结合试验抗体的检测，其他哺乳动物可以参照本标准。 2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都被修订，使用本标准的各 方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T 6682 1992分析实验室用水规格和试验方法 3器材及试剂 3.1器材 3.1.1 微量板：U型底96孔板。 3.1.2 加样器：8道5 L50 L可调式移液器，10 L750 L可
3、调式移液器。 3.1.3 各种规格塑料滴头、刻度玻璃吸管、试管、试管架。 3.1.4 离心机：低速，使用水平转子。 3.1.5 水浴锅：可调节温度。 3.2 试剂 3.2.1 抗原：按说明保存和使用。 3.2.2 标准抗原：按说明保存和使用。 3.2.3 标准阳性血清：按说明保存和使用。 3.2.4 标准阴性血清：按说明保存和使用。 3.2.5 被检血清：从被检动物静脉采血，分离血清，4保存。 3.2.6 补体：按说明保存和使用。 3.2.7 溶血素：按说明保存和使用。 3.2.8 试验用蒸馏水为GB/T 6682中的三级水。 4预备试验 4.1 2%绵羊红细胞悬液：采成年绵羊血，一份血加1.
4、2倍量的阿氏液，混匀，4保存，5 d后备用。使用前摇匀，取出10 mL，用离心机以2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，将下沉的红细胞泥用20倍量巴比妥缓冲液(VBD)洗涤，以2 000 r/min离心5 min，重复洗涤三次，最后一次离心10 min。取下沉的红细胞泥用VBD配制成2%(V/V)悬液。 4.2 溶血素效价的测定 4.2.1溶血素的稀释：取溶血素0.1 mL加VBD 9.9 mL混匀(如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素0.2 mL加VBD 9.8 mL)，制成100倍稀释的溶血素，再 按表1稀释成不同倍数。 表1 溶血素的稀释表 4.2.2补体的稀释：按表2对补体做
5、不同倍数的稀释。 表2 补体的稀释表 4.2.3 致敏红细胞悬液的制备：将不同稀释度(150016 000)的溶血素与等量的2%红细胞悬液混合，置37水浴15 min，为致敏红细胞。 4.2.4 溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表3所示，19列为溶血素稀释度(150016 000)，AH行为补体稀释度(1301 100)。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液50 L，分别滴加于19列的各孔中。吸取不同稀释度的补体50 L，分别滴于AH行各孔中，每孔再加25 L VBD，滴加完毕后，置微量振荡器上混匀，随后置37温箱中感作30min后进行初判，置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/
6、min离心5 min或置4冰 箱中过夜后进行终判。 4.2.5 溶血素效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，在最小量的补体存在下，能使90%红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素，测 定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表3的测定结果为，补体在170稀释时，发生90%溶血的最少溶血素为14 000，该14 000为一个 单位溶血素。两个单位溶血素为12 000。 表3 溶血素效价滴定判定举例表 注：+为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血 4.3 补体效价的测定： 4.3.1 按照表2配制1301100的补体； 4.3.2 使用两个单位溶血素，制备致敏红细胞悬液； 4
7、.3.3 按照表4在微量板上滴定补体效价。18列为1301100稀释的补体，各稀释度按表中定量添加，再以VBD补充至每孔50 L；每孔滴加25 L的抗原后，再滴加50 L 2%致敏红细胞悬液，充分振荡混匀后，置37温箱中感作30 min后进行初判，然后置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/min离心5 min或置4冰箱中过夜后进行终判。4.3.4补体效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，取30 L补体呈现90%溶血，20 L补体呈现 75%90%溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为25 L，如表5的测定结果，170的补体25 L为一个单位补体，试验时 123
8、456789 5001 0001 5002 0002 5003 0004 0005 0006 000 1100溶血素/mL 0.20.10.10.10.10.10.10.10.1 VBD/mL0.80.91.41.92.42.93.94.95.9 总量/mL 1.01.01.52.02.53.04.05.06.0 123456789 2030405060708090100 补体/mL 0.10.050.050.050.050.050.050.05 0.05 VBD/mL1.91.451.952.452.953.453.954.454.95 总量/mL 2.01.52.02.53.03.54.0
9、4.55.0 123456789 1500 11 000 11 500 12 000 12 500 13 000 14 000 15 000 16 000 130 + 140 + 150 + 160 + 170 90%+ 180 + 190 + 1100 + 用两个单位补体，则135补体25 L为两个单位补体。 表4 补体效价滴定 表5 补体效价判定举例表 4.4抗原效价的确认或测定：根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需测定，则在确认抗原效价后按说明稀释使用； 如需测定，则按下列步骤进行。 4.4.1 用VBD将抗原依次作150、1100、1200、1400稀释。
10、4.4.2 用VBD将阳性血清依次作120、140、180稀释。 4.4.3 标准阴性血清不作稀释。 4.4.4 按表6建立试验。 4.4.5 按原效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，当血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔出现100%溶血，而红细胞对照孔不出现溶血且红 细胞全部沉于孔底时判定抗原效价。以与阳性血清各稀释度发生完全抑制溶血的最高稀释度为一个单位抗原，正式试验使用2单位抗原，如表7所示， 抗原效价为1200，正式试验时用2单位抗原，即将抗原作1100稀释。 表 6抗原测定表 表7 抗原效价判读举例表 列号 12345678 补体稀释度 130 140 150 160 170
11、180 190 1100 A/L5050505050505050 B/L4040404040404040 C/L3030303030303030 D/L2020202020202020 E/L1010101010101010 F/L00000000 G/L H/L 列号 12345678 补体稀释度 130 140 150 160 170 180 190 1100 50 + 40 + 30 90%+ 20 + 10 + 0+ 注： +为0%溶血；+为25%溶血；+为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血。 1234 血清对照 抗原对照 补体对照 红细胞对照 150 1100 1200 1
12、400 抗原/L 2525252502500 阳性血清110/L 2525252525000 阳性血清120/L 2525252525000 阳性血清140/L 2525252525000 阳性血清180/L 2525252525000 110阴性血清/L 2525252525000 2单位补体/L 2525252525000 VBD/L00000255075 4感作12 h18 h后再置室温10 min 致敏红细胞/L 5050505050505050 37感作30 min后进行初判，然后置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/min离心5 min或置4冰箱中过夜后进行终判 5正式试验
13、5.1标准阳性血清和标准阴性血清使用前用VBD作110稀释，56水浴灭能30 min；被检血清使用前用VBD作110稀释，灭能30 min(牛：56 57；绵羊、山羊：63)。按表8建立正式试验。 表8 补体结合试验正式试验操作表 5.2 判定 5.2.1 先观察对照管结果。当阳性血清孔和红细胞对照孔出现100%抑制溶血，阴性血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔及被检血清对照孔均出现 100%溶血时判定被检血清结果。 5.2.2 对比标准溶血孔(见附录A)对被检血清管进行判定，并作如下记录： +表示90%以上抑制溶血； +表示75%以上抑制溶血； +表示50%以上抑制溶血； 表示25%以上抑制溶
14、血； -表示100%溶血。 5.2.3 判定标准：被检血清110稀释时小于50%抑制溶血为阴性。在进出境动物的检疫中，对判定标准有规定的按规定执行。 附录A (标准的附录) 标准溶血孔配制 A1 血红蛋白溶液的制备：取2%绵羊红细胞悬液1.0 mL，加入装有7.0 mL蒸馏水 的试管内，充分振荡，使红细胞全部裂解，再加入2.0 mL VBD，充分混合； A2 0.2%绵羊红细胞悬液的制备：取2%绵羊红细胞悬液1.0 mL，加入VBD 9.0 mL； A3 按表A1配制不同溶血度的标准溶血管，并充分振荡均匀。 表 A1标准溶血管配制表 150 1100 1200 1400 血清对照 抗原对照 补
15、体对照 红细胞对照 110 + + 120 + + 140 + + 180 + + 110阴性血清 + 注：+为0%溶血；+为25%溶血；+为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血 被检血清 阳性血清 阴性血清 抗原对照 补体对照 红细胞对照 试验管 对照管 110被检血清/L 252500000 110阳性血清/L 00250000 110阴性血清/L 00250000 2单位抗原/L 25 252525250 2单位补体/L 2525252525250 VBD/L02500255075 4感作12 h18 h后再置室温10 min 致敏红细胞/L 50505050505050 37感作30 min后进行初判，然后置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/min离心5 min或置4冰箱中过夜后进行终判 0102030405060708090100 A4 从标准溶血管配制表的各管中，分别取125 L加入微量板的对应孔，轻摇混匀后静置，待红细胞全部沉淀于孔底后用于试验判读的对照。 血红蛋白溶液/mL 00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0 0.2%绵羊红细胞悬液/mL 1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10