《[商检标准]-SNT 1151.5-2003 对虾杆状病毒(BP)检测方法1.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[商检标准]-SNT 1151.5-2003 对虾杆状病毒(BP)检测方法1.pdf（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、SI 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 1 5 1 . 5 -2 0 0 3 对 虾杆 状病毒 ( B P) 检 测方法 P r o t o c o l o f d e t e c t i o n f o r B a c u l o v i r u s p e n a e i 2 0 0 3 - 0 5 - 2 8 发布2 0 0 3 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N / T 1 1 5 1 . 5 -2 0 0 3 前言 本标准是采用 O I E的 水生动物健康手册 2 0 0 0 年版的检疫规
2、程。 本标准的附录 A是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 江育林、 陈莉莉、 潘坤永、 史秀杰。 S N/ T 1 1 51 .5 -2 0 0 3 对虾杆状 病毒 ( , B P) 检 测方法 范 围 本标准规定了用直接显微镜镜检和用聚合酶链式反应( P C R ) 技术检测对虾杆状病毒的方法。 本标准适用于对虾杆状病毒的鉴定及本病的流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单(
3、不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( e q v I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) G B / T 1 8 0 8 8 -2 0 0 。 出人境动物检疫采样 S N / T 1 1 5 1 . 3 -2 0 0 2 斑节对虾杆状病毒( MB V ) 诊断方法 试 荆和材料 1 阳性病毒D N A: 由O I E参考实验室提供或由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室
4、提供。 2 水: 应符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中一级水的规格。 3 T a q 酶: -2 0 保存， 不要反复冻融或温度剧烈变化。 4 d NT P : 含d C T P , d G T P , d A T P , d T T P各 1 0 mmo l / L , 5 引物: 有二对引物可选用。使用时浓度为 4 0 Is mo l / L 。其序列如下: B PI F: 5 - GAT - C TG C AA- GAGGAC - AAA- C C- 3 B P l R: 5 - A T C - G C T - A A GC T C - T G GC AT - C
5、C - 3 扩增目的基因中的 5 6 0饰 片段。 B P2 F: 5 - TGT- TC T- CAG- CCA- ATA- CAT- C G 3 B P 2 R: 5 - A T C - C T GT T T - C C A - A G C - T C T - G C - 3 扩增目的基因中的5 8 0 b y 片段。 6 异丙醇: 分析纯， 使用前预冷到一2 0 -C. 7 矿物油: 要求无DN A酶和R NA酶。 8 D NA分子量标准( Ma r k e r ) , 9 样品缓冲液: 按使用说明书中规定的比例与样品混合。 3段乳3.3.3. 3. 3 3. 3 4器材和设备 4 .
6、1 P C R扩增仪。 4 . 2 电泳仪。 4 . 3 微量移液器及吸头。 4 . 4 紫外观察灯。 4 . 5 恒温培养箱。 4 . 6 普通冰箱和低温冰箱。 4 . 7 电动匀浆器。 4 . 8 普通显微境。 4 . 9 离心机和离心管。 4 . 1 0 剪刀、 镊子。 S N / T 1 1 5 1 . 5 -2 0 0 3 5 直接光学显徽镜检查 5 . 1 原理 取活的( 鲜活的、 濒死的或有损伤的) 对虾的 肝胰腺， 或者用收集到的粪便样品做湿压片， 观察B P 在肝胰腺中形成的有特征性的三角形包涵体. 52 新鲜组织湿片法 必须是活虾， 取出肝胰腺。幼体在解剖镜下将肝胰腺摘出，
7、 置于载玻片上， 小心地制备压片。用相 差或亮视野显微镜检查， 在 肝胰腺或中肠的湿压片中， 如果观察到上皮细胞的核内 有单个或多 个四面 体 的 包涵体， 就可以诊断为B P 感染。 包涵体呈四面体或金字塔形， 从金字塔底部到顶部的尺寸为 0 . 1 li m 2 0 u m 之间， 大多数垂直的长度为8 K m -1 0 ft m 。可与MB V的 球形包涵体明显区 分开来。 可以按照 S N/ T 1 1 5 1 . 3 -2 0 0 2中的方法做组织切片后进行光镜镜检包涵体。 5 . 3 粪便检查 粪便检查可在不杀死对虾的情况下检查对虾是否带有 B P 。该方法适用于稚虾或大一些的对虾
8、， 在 用非致死方法检查有经济价值的亲虾时特别适用。把对虾放在水簇箱、 产卵箱或其他合适的水箱中待 数小时， 直到水箱底部出现粪便。用塑料虹吸管吸取排泄物， 放在玻璃离心管中。把粪便制成湿片， 直 接用显微镜检查包涵体。B P的包涵体是明显的带折射的四面体， 高度在 0 . 1 fa m-2 0 p m之间。 聚合酶链式反应( P C R ) 6 1 样品 用收集到的粪便样品、 取活的对虾肝胰腺或保存在 9 5 环的乙醇中的对虾肝胰腺样品都可以用作 P C R检测的模板。 6 . 2 D N A抽提 在粪便或肝胰腺样品中加人消化缓冲液( 见附录 A ) ， 样品和缓冲液的比例为 1 : 1 0
9、 .碾碎后， 用木 质牙签或微量吸管头把样品分散开来。样品在缓冲液里被分散后， 6 0 加热 1h ， 然后 9 5 处理 1 0 m i n . 1 2 0 0 0 g 离心2 m i n ， 把上清液移到一个新的 微量管中， 然后置于冰上保存。 移取 8 0 0 p L消化后的样品， 在含有样品的离心管中加人 6 0 0 , L抽提液 1 ( 见附录 A) ， 充分混匀 3 0 s , 1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取上层水相( 约7 0 0 I L ) 。 再加人6 5 0 L L 抽提液2 ( 见附录A ) ， 充分混匀 3 0 s , 1 2 0 0
10、 0 r / mi n离心5 mi n ， 取上层水相( 约6 0 0 u L ) 。再加人 1 . 5 倍体积的无水乙醇( 约 9 0 0 F L ) , 倒置数次混匀后， -2 0 0C, 8 h以上以沉淀核酸。1 2 0 0 0 r / mi n 离心 3 0 s ， 弃去上清。干燥后加 1 0 V L无 菌 蒸馏水溶解， 用作P C R模板。 6. 3 PCR 用P C R 检测B P时， 每个抽提样品要煮沸3 m i n ， 使D N A变性， 然后放在冰水中 迅速 冷却。 然后依 次 加人以 下试剂: T a q 酶5 U , d N T P 2 y L ， 引物( B P I 或
11、B P 2 都可以) 各2 . 5 p L , 1 0 倍用浓缩的T a q 酶 缓冲 液( 见附录A ) 1 0 K L , 2 5 m m o l / L的氯化镁( Mg C l ) 1 0 p L 、 加水到总体积为1 0 0 K L 。每管加人 5 0 p L 矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层， 再将反应管置于P C R扩增仪。9 4 下处理反应 混合物 3 m i n后， 开始 3 0 个循环( 核酸变性 9 4 C , 1 mi n ; 引物退火 6 0 0C , 1 mi n ; 延伸7 2 0 C 1 m i n ) ， 然后 7 2 下延伸5 m i n ， 最后4
12、保温。合成的P C R反应产物可通过2 %琼脂糖电泳与标准分子量进行 比较。 6 . 4 设立对照 在 6 . 1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、 阴性样品对照、 空白对照。取已知含有 B P病 毒的对虾肝胰腺组织或粪便作为阳性对照( 可以是已知的病毒 D N A核酸) 。取已知阴性的对虾肝胰腺 组织或粪便作为阴性对照。取等体积的水代替模板作为空白对照。 S N/ T 1 1 51 . 5 -2 0 0 3 6 . 5 琼脂铂电泳 用T B E电泳缓冲液( 见附录A ) 配制2 %的 琼脂糖( 含。 . 5 p g / m L E B ， 见附录A ) 平板。 将平板放 人水平电 泳槽
13、， 使电泳缓冲液刚好淹没胶面。按比例将样品和样品缓冲液混合点 样。在电泳时设立 D N A 标准 分子量M a r k e r 作对照， 推荐 使用p U C 1 9 D N A / M s p I ( H p a II ) 。 5 V / c m电泳约0 . 5 h , 当 澳酚蓝到达底部时停止， 在紫外灯下观察核酸带. 7 结果判定 P C R 后阳 性对照会出 现一条5 6 0 b y ( 当 用引物B P 1 时) 或5 8 0 b y ( 当用引物B P 2 时) 的D N A片 段. 阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品电泳后在相应位置上有带者为阳性。无带或带的大小不 对的为阴
14、性。 用上述任何一种方法( 如肝胰腺组织的湿片压片法或粪便条的湿片法或 P C R ) 都可以对 B P感染作 出确诊。因为B P 在肝胰 腺中 形成的包涵体很明显并且形态也很特异性。 用光镜直接观察新鲜样品， 或镜检固定并按常规制备切片的样品都可以很容易看到它们. S N/ T 1 1 5 1 . 5 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 试荆配制 A . 1 消化缓冲液 抓化钾( K C D Tr i s - HCI 明胶 No ni d e t P- 4 0 吐温- 2 0 蛋 白酶 K 5 0 mmo l / L 1 0 mm o l / L p H 8 . 3 0 . 1 mg
15、 / mL 0 . 4 5 % 0 . 4 5 0 a 8 0 fa g / m L A . 2 抽提液 酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇: 用 1 mo l / L T r i s 水溶液饱和的酚: 三氯甲烷 : 异戊醇=2 5 “ 2 4 闭避光保存。 混合 ， 密 A. 3抽提液 2 三氯甲烷/ 异戊醇: 将二者按 2 4: 1 的比例混合， 密闭避光保存。 A . 4 T B E电泳缓冲液( 5 倍浓缩液) T r i s 5 4 . 0 g 硼酸2 7 . 59 EDTA 2 . 9 g 用 5 mo l / L的盐酸( HC D调到 p H 8 . 0 。加水到 1 0 0 0 mL o A . S E B ( 核酸染色剂) 用水配制成 1 0 mg / mL的浓缩液。用时每 1 0 mL电泳液或琼脂中加 1 u L , A . 6 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液 Tr i s - HCI 氯化钾 ( KC D Tr i t onX- 1 00 5 0 0 mm o l / L p H 8 . 8 5 0 0 mmo l / L 1 %