[商检标准]-SNT1146-2002.pdf

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1、植物检疫-烟草环斑病毒 检疫鉴定方法 Plant quarantine Method for inspection and identification of tobacco ringspot Nepovirus SNT 1146 2002 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈枝楠、郑文华、邓琼、王东勇。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了进境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品中烟草环斑病毒的

2、检疫鉴定。 2 原理 烟草环斑病毒(Tobacco ringspot Nepovirus，简称TRSV)为等轴多面体球状病毒，直径为25 nm29 nm，属线虫传多面体病毒属成员。可侵染54 科、246种植物，其中主要的经济作物有：豆类、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝卜、唐菖蒲、百合、鸢尾、李属、苹果、葡萄、甜 樱桃等。该病毒主要分布于北美、大洋洲、欧洲、非洲等国家，具有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专业性强的病毒抗血 清等特点。通过血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)和鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。 3 仪

3、器 3.1 研钵 3.2 微量榨汁机 3.3 酶标仪 3.4 低速离心机(转速为4 000 rmin) 3.5 生物培养箱(具有光照，温度可调范围为050) 3.6 酶联板(48孔或96孔) 3.7 Eppendorf管(体积为1.5 mL) 3.8 微量移液器(分为100L、200L、1 000L单头，100 L或200 L 8孔道一支及相应吸头) 3.9 恒温水浴锅或恒温培养箱 3.10 分析电子天平 3.11 pH计 3.12 白瓷盘(40 crux 50 cm)及钝头镊子 3.13 隔离检疫温、网室 4 试剂 4.1 10 PBST缓冲液 将氯化钠(NaCl)80 g、磷酸二氢钾(KH

4、2P04)2 g、磷酸氢二钠(Na2HP04)11.5 g、氯化钾(KCl)2 g、吐温20(Tween-20)5 mL溶解于1 000 mL蒸馏水 中形成的液体。 4.2 样品提取缓冲液 将亚硫酸钠(Na2S03)1.3 g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW244 000，PVP)20 g、叠氮钠(NaN3)0.2 g、吐温20(Tween-20)20 mL溶解于1 000 mL PBST 中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至7.4，并储存于4。 4.3 包被缓冲液 将碳酸钠(Na2C03)1.59 g、碳酸氢钠(NaHC03)2.93 g、叠氮钠(NaN3)0.2 g溶解于1 000 mL蒸馏水中，用

5、浓盐酸(HCl)调节pH值至9.6，并储存于 4。 4.4 洗涤缓冲液 将1 PBST缓冲液用浓盐酸(HCl)调节pH值至7.4，并储存于4。 4.5 酶标结合物缓冲液 将1 PBST缓冲液800 mL、小牛血清白蛋白(BSA)2 g、PVP(MW244 000)20 g、叠氮钠(NaN3)0.2 g用蒸馏水定容至1 000 mL，并储存于4。 4.6 PNPP底物缓冲液 将二乙醇胺97 mL、叠氮钠(NaN3)0.2 g溶解于1 000 mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至9.8，并储存于4。 4.7 PNPP底物溶液 将4一硝基酚磷酸钠盐(p-nitrophenyl phospha

6、te，英文简称为PNPP)100 mg溶解于PNPP缓冲液100 mL中，现用现配制。 4.8 终止反应液 将氢氧化钠(NaOH)40 g溶解于1 000 mL蒸馏水中。 4.9 种子表面消毒液 将30次氯酸钠100 mL溶解于900 mL蒸馏水中制成浓度为3的消毒液。 4.10 生物试剂 可采用烟草环斑病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括烟草环斑病毒抗体(IgG)，碱性磷酸酶标记的烟草环斑病毒酶标抗体(IgG-Enzyme- Conjugated)，阳性对照和阴性对照。 4.11 2醋酸铀染液 将2 g醋酸铀溶解于98 mL蒸馏水中，定容至100 mL，现配现用。 注：本标准未作特殊说明，所使

7、用试剂均为分析纯。 5 现场检疫与抽样 5.1 抽查 按货物批量总件数的520随机抽查，最低抽查件数10件，不够最低检查数量件数的全部检查。 5.2 抽样 按照附录A的规定随机抽取植物种子、苗木、鳞球茎或其繁殖材料样品。 5.3 检测样品 每批货物送检检测样品种子应不少于1 000粒，鳞球茎应不少于20个(头)，苗木或其繁殖材料应不少于10株(枝)。若少于10株(枝)时应全部送 检。 6 检疫鉴定 6.1 双抗体夹心法(DAS ELISA) 6.1.1 样品制备 6.1.1.1 种子类 随机抽取100粒种子经3次氯酸钠表面消毒10 min后，用无菌水洗涤三次，将种子置于铺有吸水纸的白瓷盘中，分

8、五组将种子分列其中，在适宜 的发芽温度(2028)条件下催芽，直至长出第一对真叶(发芽时间大约一周)。随机抽取20株苗叶片，每株叶片约1 g(3片株4片株)，用微 量榨汁机(或每克组织加入4 mL样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于Ependorf管中，加入二分之一至三分之一Ependorf管体积样品提取缓冲液(如选 用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品。 6.1.1.2 鳞球(块)茎类 将至少20个(头)鳞球茎或块茎芽眼(处于休眠状态的还要打破休眠)在生物培养箱(2028)中催芽，直至长出叶片。随机抽取1 g叶片(3片 株4片株)，鳞球茎也可直接用解剖刀切取2 g4 g组织，用

9、微量榨汁机(或每克组织加入4 mL样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于Ependorf管 中，加入二分之一至三分之一Ependorf管体积样品提取缓冲液(如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品。 6.1.1.3 种苗类 取1 g(3片株4片株)表现症状植株叶片和无症状表现叶片，用微量榨汁机(或每克组织加入4 mL样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于 Ependorf管中，加入二分之一至三分之一Ependorf管体积样品提取缓冲液(如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品。 6.1.2 操作步骤 6.1.2.1 根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板点样孔。包括2

10、个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个4个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品 孔重复两次。 6.1.2.2 每孔加入200L抗TRSV IgG溶液，37孵育2 h4 h(或4冰箱过夜)。 6.1.2.3 空干后用1 PBST洗涤液洗涤酶联板3次或3次以上，每次3 min。 6.1.2.4 每孔加入200L待检测样品液，37孵育2 h3 h(或4冰箱过夜)。 6.1.2.5 洗涤与6.1.2.3的要求相同。 6.1.2.6 每孔加入200L酶标抗体溶液，37孵育2 h4 h(或4冰箱过夜)。 6.1.2.7 洗涤与6.1.2.3的要求相同。 6.1.2.8 每孔加入200 L PNPP底物溶液，

11、室温孵育0.5 h2 h。 6.1.2.9 必要时每孔加入50L 1 molL氢氧化钠溶液终止反应(若立即检测O.D.值则不需要)。 6.1.2.10 用肉眼观察判断酶标板颜色反应结果或者用酶标仪分别在0.5 h、1 h和2 h检测A405 nm的O.D.吸收值。 6.1.3 若采用商品化烟草环斑病毒检测试剂盒则可按照试剂盒检测指导说明进行操作。 6.2 鉴别寄主生物学检测方法 对经DAS-ELISA检测出阳性的样品，采其适量叶片，加入适量样品提取缓冲液研磨后用摩擦接种法接种栽种于室温(2025)检疫隔离温、网 室中的昆诺藜、黄瓜、白肋烟、长虹豆和菜豆“ Pinto” 等鉴别寄主植物。 昆诺藜

12、(Chenopodium quinoa)接种叶出现坏死斑或局部褪绿斑； 黄瓜(Cucumis sativus)：接种5 d7 d后，接种叶局部褪绿斑，后出现系统环斑，l0 d后植株扭曲变形； 白肋烟(Nicotiana tabacun cv.White Burley)接种后4 d7 d，接种叶出现局部褪绿斑或坏死斑，约15 d后发展为系统褪绿或坏死斑，后期 或温度超过30时新长叶无症带毒； 长豇豆(Vigna sesquipdsalis)接种4 d7 d，接种叶出现褐色的坏死斑或环斑，约10 d15 d生长点坏死，最后全株枯死； “ Pinto“菜豆(Phaseolus vulgaris cv

13、.Pinto)：接种5 d7 d后，接种叶出现局部坏死环斑，10 d15 d后系统环斑，生长点坏死。 6.3 免疫电镜 6.3.1 取经DAS-ELISA检测后样品呈阳性反应的植株叶片，用微量榨汁机制备样品提取汁液，经离心取上清液。 6.3.2 将铜网(Formvar膜)光滑面浸在一滴适量稀释浓度(200倍l 000倍)的抗病毒血清上，室温下(2025)孵育0.5 h。 6.3.3 用滴管滴10滴1xPBST洗液于铜网，洗涤0.5 h。 6.3.4 将包被了抗病毒血清的铜网浮在样品提取液上，在室温孵育1 h4 h后，洗涤同6.3.3。 6.3.5 将洗涤后的铜网浮在新配制的2醋酸铀上10 mi

14、n，经吸水纸完全吸去染色液干燥后，进行扫描电镜观察。 7 结果判定 7.1 血清学检测结果判定 当待检样品孔和阳性样品孔有颜色反应，阴性对照孔无颜色反应，且其O.D.值小于0.05，且重复检测样品O.D.值平行允许率(P)小于20时则判 定检测结果有效。取孵育1 h后检测的O.D.值，计算带测样品O.D.值和阴性对照O.D.值之比值(PN)。若PN大于2，双抗体夹心法(DAS-ELISA)血清 学检测结果判定样品带TRSV为阳性。若阳、阴性结果判定处于临界范围，需重复检测可疑样品。 样品O.D.值的平行允许率按式(1)进行计算： (1) 式中： P 平行允许率； O.D.1 重复样品1； O.

15、D.2 重复样品2。 7.2 鉴别寄主谱生物学检测结果判定 经DAS-EIASA检测为阳性的样品接种TRSV，鉴别寄主表现的典型症状符合6.2条的描述，生物学检测结果进一步确定检测样品带有TRSV。 7.3 免疫电镜结果判定 经EIASA检测和鉴别寄主谱检测都表现阳性的样品，在免疫电镜下可见粒体外包被一层电子云，病毒粒体为等轴多面体，直径约为25 nm29 nm。 7.4 结果综合判定 同时符合7.1条、7.2条或7.1条与7.3条两项结果判定的，可判定待检测样品带有TRSV病毒。 若需进一步鉴定该病毒，可采用枯斑分离、生物学检测或PCR等分子生物学检测方法进行全面鉴定。 8 样品的保存 与复

16、核 种子类样品保存6个月，发现烟草环斑病毒时样品保存1年。其他繁殖材料发现烟草环斑病毒的采病叶经液氮干燥后在-20条件下保存。检测原 始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便必要时复核。 附 录A (规范性附录) 抽 样 A.1 抽样单位 以货物批号为抽样单位，无批号的以品种为抽样单位。 A.2 抽样量 A.2.1 种子抽取样品的数见表A.1和表A.2。 A.2.1.1 一般包装的种子抽取样品份数如表A.1。 表A.1 一般包装的进出境种子抽样表 批量总重量kg 抽取份量份 10以下 1 11100 2 101500 3 5011 000 4 1 0012 000 5 2 001

17、5 000 6 5 00110 000 7 10 001100 000 每增加5 000Kg增取1份样品；不足5 000Kg的余量，计取1份样品 100 001以上 每增加50 000Kg增取1份样品；不足50 000 Kg的余量，计取1份样品 每份样品的重量： A.2.1.2 小包装的种子抽取样品份数如表A.2。 表A.2 小包装的进出境种子抽样表 A.2.2 整株植物、砧木、茎干抽取样品份数如表A.3。 表A.3 整株植物、砧木、茎干抽样表 A.2.3 鳞球茎、块根、块茎抽取样品份数如表A.4。 表A.4 鳞球茎、块根、块茎抽样表 A.2.4 接穗、芽条类抽取样品份数如表A.5。 表A.5

18、 接穗、芽条类抽样表 A.2.5 试管苗类抽取样品份数如表A.6。 表A.6 试管苗类抽样表 备 注 大粒种子，如玉米、花生、大豆等为2.5 kg； 中粒种子，加麦类、甜菜、绿豆、空心菜等为2.0 kg； 小粒种子，如黑麦草、谷子、苜蓿、白菜等为1.5 kg； 其他细小或轻质种子，如烟草、桉树等为1.0 kg 批量总重量袋(听) 抽取份量份 100以下 1 101500 2 501l 000 3 1 0015 000 4 5 00150 000 5 10 001以上 每增加5 000袋(听)增取1份。不足5 000袋(听)的余量计取1份样品 备 注 室内检验每10袋(听)计做1份检验样品 批量

19、总重量株(枝) 抽取份量份 50以下 1 51200 2 2011 000 3 l 0015 000 4 5 001以上 每增加5 000株(枝)增取1份样品，不足5 000株(枝)的余量计取1份样品 备 注 每份样品为5株(枝) 批量总重量粒 抽取份量份 500以下 1 5012 000 2 2 0015 000 3 5 00110 000 4 10 001以上 每增加1 000粒增取1份样品。不足10 000粒的余量计取1份样品 备 注 每份样品为20粒 批量总重量条(芽) 抽取份量份 100以下 1 101500 2 5012 000 3 2 0015 000 4 5 001以上 每增加5 000条(芽)增取1份样品。不足5 000条(芽)的余量计取1份样品 备注 每份样品为10条(芽) 批量总重量支(瓶) 抽取份量份 100以下 1 101500 2 5011 000 3 1 0015 000 4 5 00110 000 5 A.3 其他 货物数量不足一份的全部送室内检验，如有必要，可适当增加抽样比例。 10 001以上 每增加5 000支增取1份样品。不足5 000支的余量计取1份样品 备 注 每份样品为5支(瓶)