αSYNUCLEIN基因过度表达诱导HEK293细胞αSYNUCLEIN蛋白病理性积聚.pdf

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1、 论著 -synuclein 基因过度表达诱导 HEK293 细胞 -synuclein 蛋白病理性积聚 陈涛唐北沙廖小平严新翔张如旭张玉虎汤建光曹立郭纪锋李静 【摘要】 目的观察-synuclein 过度表达诱导 HEK293 细胞-synuclein 蛋白病理性积聚的作用。方法 将消除终止密码子-synuclein 基因扩增产物连入 pGEM T-easy 载体， DNA 测序证实后亚克隆入增强型绿色 荧光蛋白 pEGFP-N1 质粒， 通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质 2000 将野生型-synuclein-EGFP 真核表达载体转染 HEK293 细胞， 48 h 后采用 A

2、xiovert200 型倒置荧光显微镜、 荧光免疫细胞化学观察其在 细胞内的表达， HE 染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证 实并亚克隆入 pEGFP-N1 质粒后， 限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、 酶切位点上均符合实验设计。将野生 型-synuclein-EGFP 真核表达载体转染 HEK293 细胞， 48 h 后荧光显微镜下观察细胞在波长 488nm 蓝色激发 光下发出明亮的绿色荧光， 其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚； 免疫荧光细胞化学检测，EGFP 阳性细胞 同时也表现为 a-synuclein 免疫反应阳性， 某些细胞胞浆内可见-synucle

3、in 免疫阳性产物聚集； HE 结果发现 一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成， 约占细胞总数的 10.8%。结论野生型-synuclein 基因过表 达可诱导-synuclein 蛋白在 HEK293 细胞内积聚， 胞浆内嗜酸性小体形成。 【关键词】-synuclein 基因； 蛋白积聚； 帕金森病 The wild-type-synuclein over-expression to induce the protein aberrant aggregation of-synuclein in HEK293 cells in vitro*CHEN Tao1，TANG Bei-sha1，LI

4、AO Xiao-ping2，YAN Xin-xiang1，ZHANG Ru-xu1， ZHANG Yu-hu1， TANG Jian-guang1，CAO Li1， GUO Ji-feng1，LI Jing1. 1 （Department of Neurology， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan，410008 P . R . China） ； 2 （Department of Neurology，Hainan Provincial People s Hospi- tal， Haikou， Hainan，

5、571300 P . R . China） Corresponding author： TANG Bei-sha， Email： bstang7398yahoo . com . cn 【Abstract】 ObjectiveTo investigate over-expression of wild-type-synuclein inducing the aberrant aggregation of-synuclein in HEK293 cell in vitro . MethodsThe cDNA encoding the human-synuclein without the stop

6、 code was cloned into PGEM T-easy vector. Using enzyme map and DNA sequencing analyzed and determined the recombinant plas- mid，and then sub-clone the-synuclein cDNA fragment into pEGFP-N1 vector. The recombinant plasmids-synuclein- pEGFP were transfected into HEK293 cells by lipofectamin 2000. The

7、aberrant aggregation of-synuclein was measured by EGFP fluorescence，anti-synuclein immunocytochemistry. The inclusions in the cultured cells were identified with HE staining. ResultsThe restriction enzyme map suggested that eukaryotic expression vector for human wild-type- synuclein gene was constru

8、cted successfully. By EGFP fluorescence，anti-synuclein immunocytochemistry，it could be observed that the-synuclein protein could aggregate in cytoplasm and the Lewy body-like inclusions found in cytoplasm of cultured cells. ConclusionThe over-expression of wild-type-synuclein can induce protein aber

9、rant aggregation and Lewy body-like inclusions formation in cytoplasm of HEK293 cell in vitro . 【Key words】-synuclein gene； aggregation； Parkinson disease *SupportedbytheNational “ 863 ” High-TechnologyResearchandDevelopmentProgramGrant（ 2004AA227040， 2002BA711A07） ，the National“Tenth Five-Year”Scie

10、nce and Technology Program Grant （2004BA720A03） ， the National Natural Sci- ence Foundation of China （Proj.No.30370515）and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education （RFDP）（Proj. No. 20020533024） 基金项目： 国家 863 高科技研究发展计划项目 （2004AA227040， 2002BA711A07） 、“十五” 国家科技攻关计划项目 （2004BA720A03

11、） 、 国家自然科学基 金项目 （30370515） 、 高等学校博士学科点专项科研基金项目 （20020533024） 作者单位： 410008 长沙， 中南大学附属湘雅医院神经内科 陈涛（现在海南省人民医院神经内科） 、 唐北沙、 严新翔、 张如旭、 张玉虎、 汤建光、 曹 立、 郭纪锋、 李静 ； 海南省人民医院神经内科 （廖小平） 通信作者： 唐北沙， Email： bstang7398 91中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet，February 2006，Vol. 23，No. 1 -synuclein 蛋白是由 Marot

12、eaux 等 1于 1988 年从 电鲟鱼 （Torpedo） 的带电器官中首先分离出来的一种突 触前末梢蛋白。1990 年 Nakajo 等 2首次从阿尔茨海 默病 （Alzheimer s disease，AD） 患者脑内的淀粉样斑块 中分离纯化成功。它是由 140 个氨基酸残基组成的一 种酸性蛋白， 分子量为 14460 u， 包括 3 个相互分离的 区域：（1） 氨基末端： 含 1 60 个残基， 含有一个高度保 守的六聚物序列（KTKEGV） ，可与脂质双分子层结 合；（2） 中央部分： 含 61 95 个残基， 构成高度淀粉源 性的非-淀粉样肽 （NAC） ， 具有强的疏水性；（3

13、） 羧基 末端： 含 96 140 个残基， 由丰富的酸性氨基酸组成， 具有强的亲水性。研究证实， -synuclein 蛋白是 Lewy 小体的主要组成部分 3， 温度、 pH 值、 翻译后的修饰与 配体结合等均可使-synuclein 蛋白构象发生变化导致 病理性聚集及 Lewy 小体形成 4。 目前国内有关-synuclein 过表达的研究已在 SH- SY5Y、 PC12 两种细胞模型中开展 5， 6， 但尚无 HEK293 细胞模型的研究。为观察-synuclein 过表达在不同细 胞系的神经毒性， 我们应用脂质体转染法将构建成功 的人-synuclein-pEGFP 的 真 核 细

14、 胞 表 达 载 体 导 入 HEK293 细胞， 建立-synuclein 转基因细胞模型， 观察 -synuclein 过表达导致-synuclein 蛋白病理性积聚的 作用， 为进一步探讨-synuclein 在帕金森病发病机制 中的作用提供依据。 1材料与方法 1.1 -synuclein-pEGFP 载体的构建 根据 GenBank 提 供的-synuclein 完整的 CDS 序列， 消除终止密码子， 用 DNAstar 软件设计特异性引物， 序列为： 上游 5-ggAA- gATCTACCATgg ATggATgTATTCATgAAAggACTT-3 下 游 5-ggCCTTAA

15、 gggCTTCAggTTCgTAgTCTTg-3。以人胎脑 cDNA 文库 （中国医学遗传学国家重点实验室） 为模板， 用 Pyrobest 酶 （美国 Clontech） 进行 PCR 扩增。加 “A” 、 回收后连入 pGEM-Teasy 载体， 转化 JM109 感受态细菌 （中国医学遗传学国家重点实验室） ， 按照 QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol （美国 Invitrogen） 抽取并纯化质粒， 测序证实。用核酸内切酶 EcoR/ Bgl， 对-synucle- in-pGEM 质粒和 pEGFP-N1 质粒双酶切， -synuclein 片 段

16、与 pEGFP-N1 质粒片段双胶连转化宿主菌 JM109， 重 组质粒-synuclein-pEGFP 应用 EcoR/ Bgl双酶切 鉴定， 将重组质粒严格按照 Lipofectamine 2000 Protocol （美国 Invitrogen） 说明书进行转染。 1.2EK293 细胞复苏、 培 养 和 传 代复 苏 人 胚 肾 HEK293 细胞 （中国医学遗传学国家重点实验室） ， 置入 25 cm2的培养瓶， 用含 15%FBS 的 RPMI1640 （Sigma） 培 养基在 37、 5%CO2的培养箱中培养， 显微镜下观察 细胞汇合度达 95% 100%， 以 1:3 传代。

17、转染前 24 h 将细胞以每孔 1 105个细胞接种 12 孔培养板 （培养 孔预先置入盖玻片） ， 细胞汇合度达 80% 左右时准备 进行细胞转染。 1.3转染严格按照 Lipofectamine 2000 Protocol （Invit- rogen） 说明书进行转染。用不含 FBS 的 RPMI1640 培 养基洗涤细胞两次， 加入含 4L Lipofectamine 2000 及 1.6g 质粒 DNA、 不含 FBS 的 RPMI1640 培养基 1 mL 在 37、 5%CO2的培养箱中孵育 6 h， 改用含 15% FBS 的 RPMI1640 继续孵育 48 h。 1.4检测-

18、synuclein 过表达诱导细胞-synuclein 蛋白 病理性积聚 1.4.1细胞形态观察及报告基因 EGFP 表达检测 采用 Axiovert200 型倒置荧光显微镜， 观察细胞形态， 并 在 488nm 蓝色激发光下观察报告基因 EGFP 发出的绿 色荧光。 1.4.2 -synuclein 免疫荧光细胞化学检测 取加有盖 玻片的 12 孔培养板细胞， 用预冷的 PBS 漂洗 1 次， 加 入 - 20 预冷甲醇 500L，- 20 固定 20 min， 加入 0.1% tritonX-100 300L 室温静置 10 min，PBS 摇床洗 3 次， 每次 5 min， 5% BS

19、A 摇床上封闭 30 min， 加入鼠 抗人-synuclein 一抗 （1:100， Sigma） 50L 摇床上孵育 1 h， PBS 摇床洗 3 次， 每次 5 min， 5% BSA 摇床上封闭 30 min， 加入山羊抗鼠 Cy3 多克隆抗体 （1:50， Sigma） 50L 摇床上孵育 40 min， PBS 摇床洗 6 次， 单蒸水洗 1 次， 50%甘油封片， Axiovert200 型倒置荧光显微镜下观察、 照相。 1.4.3HE 染色取培养细胞， 用预冷的 PBS 洗 3 次， 用预冷的 95%酒精 - 20固定 15 min， PBS 洗 2 次 1 min， 加入苏木

20、精染液 250L， 室温静置 10 min， 自来水 浸洗 30 min 稀盐酸酒精分色数秒， 自来水浸洗， 淡氨 水使胞核蓝化， 自来水浸洗， 加入伊红染液 300L， 室 温静置 10 min， 自来水浸洗， 70%、 80%、 90%、 95% 酒 精各脱水 1 min， 100% 酒精脱水 3 min， 二甲苯透明 1 min， 100% 甘油封片， Leica 倒置显微镜观察、 照相， 在 10 倍物镜下随机选择 10 个视野， 分别进行细胞总数 及细胞胞浆内出现嗜酸性小体细胞计数， 计算阳性细 胞比率。 2结果 2.1 -synuclein-pGEM 测序结果 用 QIAprep

21、Spin 柱 抽提质粒后在 ABI 3100 型测序仪测序， 并用 DNAstar 软件将测序结果与标准序列进行对比， 结果显示： 消除 终止密码子的扩增序列与-synuclein 有 100% 的同源 02中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet，February 2006，Vol. 23，No. 1 性。 2.2 -synuclein-pEGFP 真核细胞表达载体酶切鉴定结 果限制酶切图谱显示： -synuclein-pEGFP 融合载体 经 EcoR/ Bgl双酶切后均变成两条带， 提示构建的 载体在质粒大小、 酶切位点上均符合实验设

22、计 （图 1） 。 图 1 -synuclein-pEGFP 经 EcoR/ Bgl双酶切图谱 M： 标记物； 1： - synuclein-pEGFP 酶切前； 2-5： -synuclein-pEGFP 酶切后 Fig.1Enzymatic results of-synuclein-pEGFP by EcoR/ Bgl. M： marker；lane 1：-synuclein-pEGFP；lanes 2-5： EcoR/ Bgl enzymatic product 2.3转染-synuclein-PEGFP 后细胞形态学观察转 染-synuclein-pEGFP 48 h 后， 显微镜下观

23、察活细胞， 发 现较转 pEGFP-N1 组细胞易聚集成团， 细胞内出现一 些小颗粒状沉淀 （图 2、 3） 。 2.4报告基因 EGFP 表达荧光显微镜下观察到转 染 48h 后其中某些绿色荧光细胞出现绿色荧光物质在 胞浆积聚， 形成强荧光斑块 （图 4） 。 2.5 -synuclein 免疫荧光细胞化学 免疫荧光细胞化 学检测， 转染-synuclein-pEGFP 组可见-synuclein 免疫 阳性产物在胞浆内出现聚集现象， EGFP 阳性细胞同时 也表现为-synuclein 免疫反应阳性 （图 5、 6） 。 2.6HE 染色HE 结果显示转染-synuclein-pEGFP

24、组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体 （类 Lewy 小 体） 形成 （图 7） ， 占细胞总数的 10.8%， 未转染组和转 染 pEGFP-N1 组细胞内均未见嗜酸性小体 （图 8、 9） 。 3讨论 帕金森病 （Parkinson disease， PD） 典型的病理学特征 是黑质致密部神经元胞浆内嗜酸性包涵体-Lewy 小体形 成。研究证实， -synuclein 蛋白是 Lewy 小体的主要组成 部分 4 。Lewy 小体是位于神经元胞浆内一圆形的嗜酸 性包涵体， 电镜下可见在其周围有放射状排列的疏松的 细丝包裹。Lewy 小体的主要结构是 7 25 nm 直径的纤 维丝， 用免疫组

25、化分析其组成， 发现还含有其他蛋白质， 包括泛素蛋白、 parkin 蛋白、 UCH-L、 synphilin-1、 MAP1B、 14-3-3 蛋白、 蛋白酶体亚单位、 热休克蛋白以及神经纤 维丝蛋白等。由于无法从死后的 PD 患者中获得足够的 纯 Lewy 小体， 因此尚难以对 Lewy 小体的生化组成进行 精确定论。Feany 等 7根据遗传学的研究， 制备了野生 型-synuclein 转基因的 PD 果蝇模型， 发现生长 30 60 天后该模型脑内多巴胺能神经元明显减少， 出现了类似 于人类Lewy小体的-synuclein包涵体， 为-synuclein基 图 2 转 pEGFP-

26、N1 组细胞 （1 200） 图 3转染-synuclein-pEGFP 细胞 （1 200） 图 4 转染-synuclein-pEGFP 细胞胞浆可见绿色荧光物质积聚 （1 1000） 图 5转染-synuclein-pEGFP 细胞胞浆可见-synuclein 免疫阳性产物聚集 （1 1000） 图 6转染-synuclein-pEGFP 细胞胞浆可见 EGFP 阳性 细胞同时也表现为-synuclein 免疫反应阳性 （1 1000） 图 7转染-synuclein-pEGFP 组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成 （1 400） 图 8 未转染组 （1 400） 图 9转染 pE

27、GFP-N1 组 （1 400） Fig.2Transfect pEGFP-N1 （1 200）Fig. 3Transfect-synuclein-pEGFP （1 200）Fig. 4 -synuclein protein could aggregate in cytoplasm in cultured HEK293 cells transfected by-synuclein-pEGFP （1 1000） Fig. 5The product which was immunoreactive to-synuclein could aggregate in cytoplasm in cultu

28、red HEK293 cells transfected by-synuclein-pEGFP （1 1000） Fig.6The EGFP-positive cells are also immunoreactive to-synuclein （1 1000） Fig.7HE staining demonstrates eosinophilic inclusions in the cytoplasm of the transfected cells （1 1000） Fig.8Untransfected group （1 200） Fig.9Transfected pEGFP-N1 （1 2

29、00） 12中华医学遗传学杂志 2006 年 2 月第 23 卷第 1 期Chin J Med Genet，February 2006，Vol. 23，No. 1 因在 PD 中的发病作用提供了有力的证据。在一项离 体实验中也观察到野生型-synuclein 蛋白在体外培养 时可形成带有反向平行-折叠结构的不溶解的原纤维 聚集 8。Orth 等9也在制备的稳定表达的野生型 - synuclein 基因的 HEK293 细胞内发现胞浆内-synuclein 蛋白的病理性聚集及类 Lewy 小体的形成。 我们利用 pEGFP-N1 直接、 简捷， 检测率高， 蛋白 质性质稳定， 可在多种异源生物中

30、表达而无细胞毒性， 易于构建融合蛋白， 且融合蛋白仍能保持荧光激活特 性等优点， 将经酶切、 测序证实的-synuclein 目的基因 片段插入 pEGFP-N1 载体， 构建-synuclein-pEGFP 真核 细胞表达载体， 经过酶切鉴定， 显示酶切片段符合预期 大小， 说明-synuclein-pEGFP 真核细胞表达载体构建 成功， 为建立-synuclein 转基因模型打下基础。 随后我们将-synuclein-pEGFP 真核细胞表达载体 转染 HEK293 细胞， 发现转染 48 h 后， 细胞可出现胞核 变大、 细胞内出现一些小颗粒形成等形态学方面的细 微变化； 在荧光显微镜

31、下， 我们观察到其中某些绿色荧 光细胞出现荧光物质在胞体内积聚， 形成强荧光斑块， 免疫荧光细胞化学发现-synuclein 免疫阳性产物在胞 浆内出现聚集现象； HE 染色结果也表明， 转染-synu- clein-pEGFP 真核细胞表达载体后可在一些细胞胞浆 内形成类似 PD 患者 Lewy 小体的嗜酸性小体。这些结 果进一步证实-synuclein 过表达可诱导细胞内-synu- clein 蛋白病理性积聚。 -synuclein 的过表达引起-synuclein 蛋白在细胞 内病理性积聚的机制目前尚不完全明了， 推测有以下 几种可能：（1） 自我聚集： -synuclein 蛋白结构

32、的改变依 赖于蛋白的状态及浓度， 高浓度的-synuclein 蛋白具 有自我凝集现象， 当在局部积累到一定程度时可从寡 聚体逐渐聚集成多聚体并形成包涵体， McLean 等 10用 荧光共振能量转移技术观察发现-synuclein 蛋白的氨 基端和羧基端都与膜有交联， 氨基端和羧基端有微弱 的相互作用， 在高浓度的-synuclein 蛋白脂质囊中， 可 使-synuclein 蛋白的无序未折叠结构转变为淀粉纤维 样的-折叠结构， 从而具有高度聚集能力；（2） 与其它 蛋白相互作用： -synuclein 过表达使细胞内-synuclein 蛋白浓度增高造成 “分子拥挤” 现象 11， 从而

33、与其它蛋 白结合导致积聚， 如能促使蛋白聚集的 A淀粉样蛋 白 4， 促使 -synuclein 蛋白形成 Lewy 小体的 synphilin-1 蛋白 12； （3） 泛素-蛋白酶体通路 （ubiquitin proteasome pathway， UPP） 受损： -synuclein 蛋白浓度增高时可与蛋 白酶体 26S 中的亚单位 6S 结合， 抑制其活性， 从而导 致细胞内-synuclein 蛋白不能被 UPP 及时有效的降解 而出现病理性积聚， 形成 Lewy 小体 13； （4）氧化应激： 高浓度的-synuclein 蛋白可增加细胞内活性氧 ROS 的 生成， ROS 加剧

34、-synuclein 蛋白的氧化损伤， 加速聚集 及包涵体形成， Foley 等 14发现当 -synuclein 蛋白与细 胞色素 C 或 H2O2共同孵育时， 可促进聚集， 并可被抗 氧化剂抑制， 这也提示-synuclein 蛋白的病理性积聚 与氧化应激有关；（5） 其他： 如-synuclein 过表达可破 坏微管蛋白的组装使微管蛋白释放， 促进-synuclein 蛋白纤维化导致 Lewy 小体形成； -synuclein 过表达导 致线粒体功能不良引起-synuclein 蛋白出现病理性积 聚 15。 参考文献 1Maroteaux L，Campanelli JT，Scheller

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36、，Lee VM，et al . Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature，1997，388:839-840. 4Kim TD，Paik SR， Yang CH，et al . Structural changes in alpha-synuclein affect its chaperone-like activity in vitro .Protein Sci，2000， 9 : 2489- 2496. 5Zhang YX， Yang H， Cai Q， et al . The influence of overexpression alpha- synu

37、clein -EGFP on formation of inclusion and mitochondrialultra structure in SH-SY5Y cells in vitro . Chin J Neuroanatomy，2003， 19:253-256. 张 宇新， 杨慧， 蔡青， 等 .-synuclein-EGFP 在体外培养 SH-SY5Y 细胞 中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响 . 神经解剖学杂 志， 2003， 19:253-256. 6Li L， Ni PH， Liu ZG， et al .Construction of eukaryotic expre

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