α生育酚对精索静脉曲张大鼠生殖细胞凋亡的影响.pdf

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1、临床泌尿外科杂志 2 0 0 6年 1 月第 2 1 卷第 1 期 6 5 (X 一 生育酚对精索静脉曲张大鼠生殖细胞凋亡的影响 赖建生 夏强 张孝斌2 张杰， 许胜利 赵国平 郑东升 摘要 目的: 探讨a 一 生育酚对精索静脉曲张( V C ) 大鼠翠丸生殖细胞损害的保护作用。方法: 采用成年雄 性Wi s t a : 大鼠1 0只复制精索静脉曲张疾病模型. 4 周后开始每日肌注。 一 生育酚0 . 5 m g / ( 1 0 0 g 体重) ， 共4 周( 生 育酚组) 。同时设手术组及假手术组进行对照。8 周后用原位末端脱氧核昔酸转移酶标记法( T U N E I ) 检测擎丸 生殖细胞

2、凋亡指数( A I ) 。结果: 生育酚组动物左侧肇丸重量显著高于手术组( P 0 . 0 5 ) ， 低于假手术组( P 0 . 0 5 ) ; 生育酚组细胞凋亡率 左侧( 5 . 3 4 土1 . 2 8 ) %， 右侧( 5 . 8 7 士1 . 2 5 ) % 高于假手术组 左侧( 4 . 7 2 土1 . 0 2 ) %, 右侧( 4 . 8 8 士1 . 2 8 ) % ( P 0 . 0 5 ) ， 而显著低于手术组 左侧( 9 . 0 5 士2 . 5 1 ) 0 0 ， 右侧( 7 . 2 2 士1 . 3 5 ) % ( P 0 . 0 5 ) 。结论: a 一 生育酚能降

3、低精索静脉曲张大鼠生殖细胞的凋亡指数， 延缓架丸细胞损害的病程， 对精索静脉曲 张导致的肇丸损害具有一定的保护作用。 【 关键词 动物模型; a 一 生育酚; 精索静脉曲张; 细胞凋亡 中 图 分 类号 R 6 9 7 . 2 4 文 献 标识 码 A 文 章 编 号 1 1 0 0 1 - 1 4 2 0 ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 6 5 - 0 3 T h e e f f e c t s o f a - t o c o p h e r o l o n s p e r m a t e g e n i c c e l l u l a r a p o p t o s i s i

4、 n v a r i c o c e l e L A I J i a n s h e n g X I A Q i a n g Z H A N G X i a o b i n 2 H A N G J i e 2 X U S h e n g l i Z H A O G u o p i n g Z H E N G D o n g s h e n g ( D e p a r t m e n t o f U r o l o g y , J i a n g m e n Mu n i c i p a l H o s p i t a l ，G u a n g d o n g P r o v i n c e ，

5、 J i a n g m e n 5 2 9 0 0 0 ， C h i n a ; D e p a r t m e n t o f U r o l o g y , P e o p l e s H o s p i t a l o f Wu h a n U n i v e r s i t y ) A b s t r a c t O b j e c t i v e : T o s t u d y t h e e f f e c t s o f a 一t o c o p h e r o l o n s p e r m a t e g e n i c c e l l u l a r a p o p t

6、 o s i s i n e x p e r i m e n t a l v a r i c o c e l e i n r a t s . Me t h o d s : T h i r t y a d u l t m a l e Wi s t a r r a t s w e r e r a n d o m i z e d i n t o 3 g r o u p s ( n=1 0 ) : t r e a t e d g r o u p ( T G ) ， o p e r a t i o n g r o u p ( O G ) ， a n d s h a m o p e r a t io n

7、g r o u p ( S O G ) . R a t s i n t r e a t e d g r o u p w e r e i n j e c t e d i n t r a m u s c u - l o u s l y a - t o c o p h e r o l ( 0 . 5 m g / 1 0 0 g b o d y - w e i g h t , o n e t i m e d a i l y f o r 4 w e e k s ) a f t e r v a r i c o c e l e b e i n g i n d u c e d b y p a r t i a

8、l l i g a t io n o f t h e l e f t r e n a l v e i n f o r 4 w e e k s . Al l t h e r a t s w e r e b r e e d i n t h e s i mi l a r c o n d i t i o n f o r e i g h t w e e k s . T h e a p o p t o s i s c e l l s w e r e d e t e c t e d b y i n s i t u t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i t y l

9、 t r a n s f e r a s e m e d i a t e d d T U P n i c k e n d l a b l e l i n g ( T U N E I )R e s u l t s : T h e l e f t v e n a s p e r m a t i c a o f T G a n d O G w e r e f o u n d c i r s o i d m a r k e d l y c o m p a r i n g w i t h S O G ( P 0 . 0 1 ) . t h e w e i g h t o f l e f t t e s

10、t i c l e i n T G w a s i n t e r v e n e d b e t w e e n t h e O G a n d S O G( P 0 . 0 5 ) .T h e c h a n g e s o f h i s t o l o g y w e r e e x t r a m a r k e d b o t h i n T G a n d O G . T h e a p o p t o s i s i n d e x o f T G w a k l o w e r t h a n t h a t o f O G( P 0 . 0 5 ) ， a n d h i

11、g h e r t h a n t h a t o f S O G ( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n s : I t s h o w s t h a t a - t o c o p h e r o l c a n d e c r e a s e t h e a p o p t o - s i s i n d e x i n g e r m c e l l s o f v a r i c o c l e r a t s , a n d s t o w d o w n t h e p r o c e e d i n g o f t e s t i c u l

12、a r i n j u r e d . K e y w o r d s A n i m a l m o d e l ; a - T o c o p h e r o l ; V a r i c o c e l e ; C e l l a p o p t o s i s 已有研究证实， 精索静脉曲张( V C ) 的病理生 理过程会导致局部氧自由基增多， 并介导细胞凋 亡， 致使肇丸生殖细胞凋亡增加 。 从而影响生育 能力。本研究使用氧自由基清除剂 a 一 生育酚， 对 V C疾病模型进行药物于预性研究. 采用原位末端 脱氧核昔酸转移酶标记( i n s i t u t e r m i n a l

13、 d e o x y n u - c l e o t i t y l t r a n s f e r a s e d T U P n i c k e n d l a b e l i n g ， T U N E I . ) 技术， 初步探讨 a 一 生育酚对V C致肇丸损 害的保护作用。 1 材料与方法 1 . 1 动物分组 成年雄性 Wi s t a r 大白鼠3 0只， 鼠龄( 6 0 士1 0 ) 天， 体重2 7 0. 3 2 0 g ( 购自湖北省医学科学研究院 实验动物中心， 动物证号: 医动字第 1 9 - 0 8 4 号) ， 随 1 广东省江门市人民医院泌尿外科( 广东江门，

14、5 2 9 0 0 0 ) “ 武汉大学人民医院泌尿外科 机分成 3 组， 每组 1 0 只。生育酚组: 部分结扎大鼠 左肾静脉， 使其外径缩窄到 1 m m， 复制精索静脉曲 张疾病模型， 模型成功后 4 周开始每日肌注 。 一 生育 酚0 . 5 m g / ( 1 0 0 g 体重) 共4 周; 手术组: 为部分结 扎大鼠左肾静脉， 造成精索静脉曲张， 不用药; 同 时设假手术组: 只行左肾静脉分离， 不予结扎。3 组 大鼠均在同一条件下饲养至 8 周后进行观察。 1 . 2 检测方法 将实验大鼠麻醉后开腹， 显露左侧肾静脉和精 索内静脉， 用带测微器的目镜测量精索静脉直径， 观察其曲张

15、程度。取出双侧翠丸， 分析天平分别称 重。切片苏木精一 伊红染色、 封片制成病理切片， 观 察病理学变化。 沿纵轴将罕丸分成两半， 中性福尔马林固定、 石蜡包埋、 切片备检; T UN E L试剂盒购自德国 B M 公司， 按试剂盒说明书操作。光镜下观察凋亡细胞 6 6J o u r n a l o f C l i n i c a l Ur o l o g y , J a n 2 0 0 6 , Vo l 2 1 ，N o 1 并计数， 每张切片选5 个高倍视野( X 4 0 0 ) ， 计数正 常细胞和凋亡细胞， 求出凋亡指数( a p o p t o s i s i n - d e x ,

16、 AI ) 。 1 . 3 统计学方法 计量数据以牙 士、 表示， 各组间均数比较应用t 检验。使用的统计软件包为 S P S S ( C h i c a g o , U S A) 。以P 0 . 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 生育酚组与手术组大鼠左精索静脉均呈不同 程度的曲张， 两组间左精索静脉直径比较差异无统 计学意义仁 ( 0 . 9 7 士0 . 1 5 ) m m 对( 0 . 9 6 士0 . 1 9 ) m m ， 两组与假手术组 ( 0 . 1 8 士0 . 0 7 ) m m 相比， 差异均有统计学意义( P。 . 0 1 ) . 肇丸重量变化见表 t o 表 1

17、三组动物塞丸重量变化 组别只数左侧右侧 生育酚组 手术组 假手术组 1 0 1 0 1 0 1 . 5 1 9 士0 . 0 1 8 “ 1 . 5 0 3 士0 . 0 2 6 2 1 . 5 3 8 士0 . 0 2 8 1 . 5 2 0 士0 . 0 3 2 1 . 5 1 6 士0 . 0 3 5 2 1 . 5 3 3 士0 . 0 3 6 与手术组、 假手术组相比 ) P 0 . 0 5 ， 与假手术组比较 2 P 0 . 0 5 假手术组双侧梁丸无明显病理改变; 手术组及 生育酚组9 0 %的大鼠双侧攀丸均出现不同程度的 生精阻滞、 曲细精管萎缩、 生精细胞稀少、 生精上皮 变

18、薄、 未成熟曲细精管向管腔内脱落、 生精细胞与 基低细胞脱离等， 以左侧为著; 生育酚组与手术组 相比无明显改善。 凋亡细胞胞浆收缩， 胞核致密深染呈棕黄色颗 粒或碎片为凋亡细胞染色阳性。凋亡细胞仍是大 多分布于精原细胞和精母细胞， 少见于精子细胞; 生育酚组生殖细胞凋亡率高于假手术组( 尸 0 . 0 5 ) ， 但显著低于手术组( P 0 . 0 1 )表2 ) 0 表 2 生殖细胞凋 A l 的变化 组别只数 左侧 . 8 7 土 1 . . 0 5十 2 . 右侧 生育酚组 手术组 假手术组 1 0 1 0 1 0 . 3 4 士 1 . 2 8 . 2 2 士1 . 3 5 “ 一一

19、 4 . 7 2 士1 . 0 2 2 4 . 8 8 士 1 . 2 8 与生育酚组比较， “ P 0 . O 1 , 2 P 0 . 0 5 3 讨论 精索 V C是男性不育的首位原因。临床上精 索V C的治疗方案是只对有手术指征者行外科治 疗 2 。然而有资料显示， 单纯外科治疗并不能很好 的改善精液质量和提高受孕率， 使精索 V C治疗的 传统观念面临极大的挑战c a l . K a mi s c h k e等C 4 对 精索 V C治疗手段做了大量的探索， 大多是致力于 手术方式的改进; 也有少数是应用提高生精功能的 药物， 包括相关激素、 中药等进行经验性研究， 取得 了一定的效果

20、。 已有研究证实， 精索 V C可以导致大鼠翠丸生 长缓慢， 生精细胞凋亡增加， 推测这一可能是由 R O S 介导的 5 ) 。本文资料显示， 生育酚使精索 V C 和肇丸重量及组织学发生明显变化， 表明本研究所 采用疾病模型是成功、 可靠的。本研究生育酚组大 鼠左侧翠丸重量虽然仍低于假手术组( P 0 . 0 5 ) , 但与手术组相比有明显增加; 生育酚组生殖细胞凋 亡率高于假手术组( P 0 . 0 1 ) ; 说明a 一 生育酚对精 索 V C大鼠生精细胞的凋亡有抑制作用。 生育酚是目前公认的氧自由基清除剂， 有增强 机体抗氧化能力。它是在植物中存在的脂溶性物 质， 有。 , P ,

21、 7 , 8 四种， 。 一 生育酚是其中活性最强的形 式 6 。a 一 生育酚这种脂溶性化合物进人体内主要 存在于细胞膜中， 其结构中具有酚性经基， 可将活 泼的氢原子传递给氧自由基， 使变为稳定的分子; 从而作为抗氧化剂有效地捕捉和清除人体内过量 的超氧阴离子自由基( . O : 一 ) 、 经基自由基( H O ) , 氢过氧自由基( H Z O Z ) 、 脂类 自由基、 烷类自由基、 单线态氧和过氧化氢等， 阻断和防止自由基引发并 加剧氧化和过氧化连锁反应过程， 保护生物膜免受 氧化和过氧化损伤 7 ， 促进机体免疫球蛋白的合成 和稳定， 增强机体抵抗力， 阻断亚硝胺等致癌物质 的形

22、成。在其它诸多领域中已证实， a 一 生育酚能够 抑制R O S介导的细胞凋亡过程 “ o R O S引起细胞 D N A分子损伤， 并由参与调控的基因产物诱导细 胞凋亡。 本研究证实， 生殖细胞的异常凋亡是 v C影响 生育力的重要原因之一， 并且 V C对肇丸细胞的损 害是进行性的， 因此， 在临床上， V C的早期诊断、 早 期治疗非常重要; 同时， 证实了氧自由基清除剂 a - 生育酚对 V C大鼠生殖细胞的凋亡有抑制作用， 说 明它对 V C病理生理过程导致的梁丸损害存在一 定的保护作用， 能延缓 V C的病程。据此推断， 临 床上对于轻症 V C者使用 a 一 生育酚进行治疗应当

23、有一定的疗效; V C术后常规加用 a 一 生育酚辅助治 疗对提高临床疗效可能有帮助。本实验中， 经过 a - 生育酚治疗的大鼠肇丸光镜下组织学未见明显恢 复， 说明V C疾病的血流淤积的病理生理变化并未 被阻断， 提示在临床上针对 V C适时的手术治疗仍 是必要的。 参考文献 1 夏强， 张孝斌， 张杰. 精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的 实验研究 J . 中华男科学， 2 0 0 2 , 8 ( 6 ) : 4 1 4 -4 1 5 . ( 下转第6 9页) 临床泌尿外科杂志 2 0 0 6 年 1 月第 2 1 卷第 1 期 6 9 方法， 从幼龄小鼠的前肢获取肌细胞采用差速贴壁 法来纯化

24、肌干细胞， 按细胞贴壁的快慢将细胞分为 P P 1 - P P 6 , ; 采用免疫组化测定支架蛋白以进行肌 细胞活性鉴定。结果 P P 1 - P P 6支架蛋白阳性细 胞分别为 7 %一7 8 %。将各组细胞行细胞移植发 现: 将 P P 5 -P P 6 细胞移植后细胞可长期存活。而 选择幼体的骨骼肌干细胞进行细胞移植治疗就只 能采用异体注射， 这将不可避免地带来排斥反应， 使治疗不能获得永久的效果。Y o k o y a m a 等 2 采 用大鼠制成压力性尿失禁模型， 然后用上述骨骼肌 干细胞纯化方法培养骨骼肌干细胞行自体尿道周 围注射治疗， 取得了良好的效果。Y i o u等C S

25、 ) 研究 骨骼肌细胞自体注射在尿道括约肌损伤中的作用， 发现骨骼肌细胞可明显促进括约肌的修复。 随着组织工程技术的发展， 自 体骨骼肌干细胞 移植可以治疗多种疾病， 如下尿路功能障碍、 D MD 、 心肌梗塞等。尤其是下尿路功能障碍， 特别 是尿失禁， 病变部位局限， 位置表浅， 易于注射。还 有研究表明， 骨骼肌干细胞移植后不仅可分裂成肌 纤维， 在体内微环境的作用下还可分化成其他细胞 类型“ ， ， 甚至还可促进原组织神经再生 。所以， 自体 M D C尿道周围注射不仅单纯引起尿道周围 肌肉增生增加尿道阻力， 而且有可能改善下尿路肌 肉本身的功能， 是压力性尿失禁的理想治疗方法。 另外，

26、 MD C还可作为载体将外源基因导人体内行 基因治疗。 本研究显示， 川鼠尾胶原包被培养瓶， 以促进 肌干细胞的贴壁生长， 成功地分离培养了成年大白 鼠的骨骼肌干细胞， 这在国内尚未见报道。另外， 传统方法采用结蛋自( d e s m i n ) 抗体进行骨骼肌细 胞的鉴定。 但平滑肌细胞也是成纤维样细胞， 而且 也含有结蛋白. 以往的研究忽视一r 平滑肌细胞的污 染。本研究采用了骨骼肌肌动蛋白抗体对骨骼肌 干细胞、 成纤维细胞和平滑肌细胞成功地进行了鉴 别; 但同时也发现， P P 1 , P P 2中成纤维细胞含量丰 富， 生长活跃， 而肌干细胞含量丰富的 P P 3 - - - P P

27、6 细胞生长缓慢， 并出现细胞衰老现象。这些与 Q u 等 3 及国外的其他作者的研究有较大差别， 这可能 与本实验采用的是成年大鼠或组织的消化分离细 胞的方法有关， 尚待进一步研究证实。 本研究已成功建立了成年动物骨骼肌干细胞 的纯化及培养方法， 为将来进行自 体骨骼肌干细胞 尿道周围注射， 治疗压力性尿失禁打下基础。 参考文献 1 L e e J Y, C a n n o n T W, P r u c h n i c R . e t a l . T h e e f f e c t s o f p e r i u r e t h r a l m u s c l e - d e r i v e

28、 d s t e m c e l l e c t i o n o n l e a k p o i n t p r e s s u r e i n a r a t mo d e l o f s t r e s s u r i n a r y i n c o n t i - n e n c e J . I n t U r o g y n e c o l J ， 2 0 0 3 ， 1 4 : 3 1 一3 7 . 2 Y o k o y a m a T, Y o s h i m u r a N, D h i r R , e t a l . P e r s i s t e n c e a n d s

29、 u r v i v a l o f a u t o l o g o u s mu s c l e d e r i v e d c e l l s v e r s u s b o v i n e c o l l a g e n a s p o t e n t i a l t r e a t m e n t o f s t r e s s u r i n a r y i n c o n t i n e n c e 仁 J . J U r o l , 2 0 0 1 ， 1 6 5 ; 2 7 1 一2 7 6 . 3 Q u Z , B a l k i r L , v a n D e u t e

30、 k o m J C T, e t a l . D e v e l o p - m e n t o f a p p r o a c h e s t o i m p r o v e c e l l s u r v i v a l i n m y o b l a s t t r a n s f e r t h e r a p y J . J C e l l B i o l , 1 9 9 8 ， 1 4 2 : 1 2 5 7 一1 2 6 7 . 4 B e a u c h a m p J R , Mo r g a n J E , P a g e l C N, e t a l . D y - n

31、 a mi c s o f m y o b l a s t t r a n s p l a n t a t i o n r e v e a l a d i s c r e t e m i - n o r i t y o f p r e c u r s o r s w i t h s t e m c e l l 一l i k e p r o p e r t i e s a s t h e m y o g e n i c s o u r c e 仁 J . J C e l l B i o l , 1 9 9 9 ， 1 4 4 : 1 1 1 3 一 1 1 2 2 . 5 Y i o u R ,

32、 D r e y f u s P , C h o p i n D K, e t a l . Mu s c l e p r e c u r - s o r c e l l a u t o g r a f t i n g i n a m u r i n e m o d e u r e t h r a l s p h i n c - t e r i n j u r y J . B J U I n t , 2 0 0 2 , 8 9 ( 3 ) : 2 9 8 一3 0 2 . 6 ( b i n RCJ ， Z i b a i t i s A, Ka o R L . C e l l u l a r

33、c a r d i o my o - p l a s t y : m y o c a r d i a l r e g e n e r a t i o n w i t h s a t e l l i t e c e l l i m - p l a n t a t i o n J . A n n T h o r a c S u r g , 1 9 9 5 ， 6 0 : 1 2 一1 8 . 7 H u a r d J . V e r r e a u l t S , R o y R . e t a l . H i g h e f f i c i e n c y o f mu s c l e r e

34、 g e n e r a t i o n f o l l o w i n g h u m a n m y o b l a s t c l o n e t r a n s p l a n t a t i o n i n S L I D m i c e J . J C l i n I n v e s t ，1 9 9 4 ， 9 3 : 5 8 6 一 5 9 9 . ( 收稿 日期 : 2 0 0 5 - 1 0 - 2 0 ) ( 上接 第 6 6页) 2 6 3 5 I , i H， D u b o c q F , J ia n g Y . e t a l . E f f e c t o f

35、 s u r g i c a l l y i n - d u c e d v a r i c o c e l e o n t e s t i c u l a r b l o o d f l o w a n d s e r t o l i c e l l f u n c t i o n 巨 J . U r o l o g y , 1 9 9 9 , 5 3 ( 6 ) : 1 2 5 8 一1 2 6 2 . N i e s c h l a g E . H e r t l e I ， F i s c h e d i c k A。 e t a l . U p d a t e o n t r e a

36、 t m e n t o f v a r i c o c e l e : c o u n s e l l i n g a s e f f e c t i v e a s o c u - l u s i o n o f t h e v e n a s p e r m a t i c a J 刁 .H u m R e p r o d , 1 9 9 8 ， 1 3 ( 8 ) : 2 1 4 7 一2 1 5 0 . K a m i s c h k e A, N i e s c h l a g E . V a r i c o c e l e t r e a t me n t i n t h e l

37、 i g h t o f e v i d e n c e - b a s e d a n d r o l o g y J 习 .H u m R e p r o d Up d a t e , 2 0 0 1 , 7 ( I ) : 6 5 一6 9 . 息余波， 杨志学， 李稻， 等.大鼠精索静脉曲张对策丸氧 7 4 8 自由基和L P ( ) 浓度的影响 J 习 .生殖与避孕， 1 9 9 4 , 1 4 ( 4 ) : 2 9 7 一3 0 1 . C l a y c o m b e K J ， Me y d a n i S N . V i t a m i n E a n d g e n o

38、 m e s t a b i l i t y J . Mu t a t R e s , 2 0 0 1 , 4 7 5 ( 1 一2 ) : 3 7 一4 4 . Wo o d s J R J r . R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s a n d p r e t e r m p r e m a t u r e r u p t u r e o f m e m b e r a n e s - a r e v i e w J 口 .P l a c e n - t a , 2 0 0 1 . 2 2 ( S u p p l A) : S 3 8 一1 4 . B r o n D , A s m i s R . V i t a mi n E a n d t h e p r e v e n t i o n o f a t h e r o s c l e r o s i s J 习 .I n t J V i t a m N u t r R e s . 2 0 0 1 , 7 1 ( 1 ) : 1 8 一 2 4 . ( 收稿 4期 : 2 0 0 5 - 1 0 - 1 4 )