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1、书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 进出口食品中隐孢子虫检测方法 犘 犆 犚法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犆 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 狉 犻 犱 犻 狌 犿犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无
2、需注册 即可下载 书书书 前 言 本标准的附录为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人： 李晓虹、 闫东丽、 韩伟。 本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 进出口食品中隐孢子虫检测方法 犘 犆 犚法 范围 本标准规定了食品中隐孢子虫的 检验方法。 本标准适用于果汁、 牛
3、奶、 叶类蔬菜及水果、 贝壳类中隐孢子虫的快速检验。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 分析实验室用水规格和实验方法（ ， ： ） 基因检验实验室技术要求 定义、 术语和缩略语 下列术语、 定义和缩略语适用于本标准。 定义和术语 隐孢子虫 犮 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 狉 犻 犱 犻 狌 犿 隐孢子虫为
4、顶端复合体门、 孢子虫纲、 球虫亚纲、 真球虫目、 艾美球虫亚目、 隐孢子虫科、 隐孢子虫 属。是直径在（ ）（ ） 的极微小的， 无法以肉眼辨识的单细胞寄生虫。 隐孢子虫寄生于人或动物的胃肠道上皮和呼吸道上皮微绒毛， 其隐孢子虫病是一种重要的人畜共患寄 生虫病。感染多经过食源性或水源性传播途径感染。目前公认的隐孢子虫有效种为 个种。其中感 染人最主要的是微小隐孢子虫（ 犆狆 犪 狉 狏 狌 犿） 。 缩略语 犐 犕 犛 犻 犿犿 狌 狀 狅 犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮 狊 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀 免疫磁珠分离。 犚 犉 犔 犘 犚 犲 狊 狋 狉 犻 犮 狋 犻 狅 狀犉 狉
5、 犪 犵 犿 犲 狀 狋犔 犲 狀 犵 狋 犺犘 狅 犾 狔 犿 狅 狉 狆 犺 犻 狊 犿 限制性片段长度多态性分析。 设备和材料 电子天平： 感量为 。 显微镜： 倍。 离心机： 。 恒温水浴锅： ， 。 扩增仪。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 电泳仪。 磁极和混匀器。 微波炉。 紫外检测仪或凝胶成像系统。 微量可调移液器： ， ， ， 。 卡（ 公司或同类产品） 。 直径打孔机（ 公司或同类产
6、品） 。 振荡器。 摇床。 过滤均质袋（ ） （ 法国犐 狀 狋 犲 狉 狊 犮 犻 犲 狀 犮 犲， 公司或同类产品） 。 试剂 除另有规定外， 试剂为分析纯或生化试剂， 水为灭菌双蒸水。 抗隐孢子虫磁珠试剂盒（ 丹麦 公司或同类产品） 。 抽提试剂盒。 犜 犪 狇 犜 犪 狇 、 、 （ ） 、 、 、 其他稳定剂和增强剂 ： 北京天为时代公司或同类 产品。 。 。 （ ） 。 琼脂糖。 溴化乙锭。 引物： 见表。 表 隐孢子虫引物序列及扩增片段长度 扩增 引物名称引物序列（ ）扩增片段大小 注： 为 （ 正向） ， 为 （ 反向） 。 纯化试剂： 公司或同类产品。 卡洗液 ： ， ； ，
7、 公司或同 类产品。 （ 牛血清白蛋白） 。 盐酸（ ） 。 氢氧化钠（ ） 。 电泳缓冲液（ 储备液 ） ： 碱 、 冰乙酸 、 （ ） ， 用蒸馏水定容至 ， 混匀， 室温保存。使用时取 电泳缓冲液， 稀释为 工作液即可。 犞 狊 狆限制性内切酶： 公司或同类产品。 犛 狊 狆限制性内切酶： 公司或同类产品。 质控标准卵囊： 微小隐孢子虫（ 犆 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犪 狉 狏 狌 犿） 、 贝氏隐孢子虫（犆 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e
8、t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 狉 犻 犱 犻 狌 犿犫 犪 犻 犾 犲 狔 犻） 、 安氏隐孢子虫（犆 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 狉 犻 犱 犻 狌 犿犪 狀 犱 犲 狉 狊 狅 狀 犻） 、 犬隐孢子虫（犆 狉 狔 狆 狋 狅 狊 狆 狅 狉 犻 犱 犻 狌 犿 犮 犪 狀 犻 狊） 或适宜的隐孢子虫卵囊。阴性质控菌株为适宜的非隐孢子虫卵囊。 检验步骤 方法提要 食品经处理后， 用 方法分离纯化隐孢子虫卵囊， 再用 卡提取 ， 以提取的 为模 板进行巢式 扩增， 琼脂糖凝胶电泳检验 产物是否有特征条带，
9、 从而对食品中隐孢子虫进行快 速检验。如有必要， 可鉴定到种。 检验程序 隐孢子虫 检验程序见图。 图 隐孢子虫犘 犆 犚检验程序 检测步骤 食品样品处理 对于饮料类样品直接以无菌操作取样品 进行下一步的 操作。 对于叶类或贝壳类样品称取 放入过滤均质袋中， 加入 双蒸水， 密封后放至摇床 上轻轻振荡 ， 将滤液倾倒入个 离心管中， 犵离心 ； 去上清液， 用双蒸水重悬 个 离心管中沉淀物及部分上清液， 将重悬物转移至另一 离心管， 总体积不得超过 ， 然后进行下一步的 操作。 隐孢子虫卵囊的分离与纯化 将处理好的样品 ， 用抗隐孢子虫磁珠试剂盒分离纯化隐孢子虫卵囊， 其操作参照说明书， 最
10、后得到的卵囊悬液进行下一步的 抽提。保存剩余分离纯化好的隐孢子虫卵囊， 以备确证试验 使用。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 模板犇 犖 犃提取 将上述分离纯化好的隐孢子虫卵囊约 滴加到 卡上， 按 卡操作说明书提取模板 。所提取的模板 ， 可常温下储存， 也可直接放入 管中进行后续反应。 巢式犘 犆 犚扩增（ 可参照相关试剂盒操作说明） 初始 （ ） ： 反应体系为 模板（ 中制得的 滤膜片一片）
11、， 犜 犪 狇 ； ； 引物各 ； 双蒸水 。反应条件： 预变性 ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ， 个循环； 延伸 。扩 增产物长度为 。 巢式 （ ） ： 反应体系为 模板（ 第一轮 产物） ， ； 引物各； 双蒸水 ； 反应条件： 预变性 ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ， 个循环； 延伸 。扩增产物长度为 。 质量控制 检测过程中分别设阳性对照、 阴性对照和空白对照。阳性对照为 中所列的隐孢子虫卵囊或适 宜的质控隐孢子虫卵囊， 阴性对照为非隐孢子虫卵囊， 空白对照加入无菌水作为对照。 巢式犘 犆 犚扩增产物电泳检验 用 电泳缓冲液配制琼脂糖电泳凝胶（ 溴化乙锭终浓度达到 ） ， 制胶。在电
12、 泳槽中加入电泳缓冲液， 使液面没过胶面。将 第二轮 扩增产物点样， 同时加入 。 恒压， 电泳 。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果， 拍照并 记录结果。 结果及判断 犘 犆 犚扩增产物电泳检验结果 隐孢子虫 扩增产物为 。 结果判断 阴性对照和空白对照均未出现特征条带； 阳性对照出现预期大小的特征条带； 待测样品出现预 期大小的特征条带， 怀疑存在隐孢子虫， 需进一步确证； 待测样品未出现预期大小的扩增条带， 为阴 性结果。 确证试验 将 中出现特征性条带对应的卵囊， 参照 方法进行镜检鉴定。 结果表述 扩增产物电泳检验结果阳性， 且经确证为阳性， 报告检出隐孢子虫。 扩增产物电泳检验结果阴性，
13、 报告未检出隐孢子虫。 微小隐孢子虫种鉴定 犚 犉 犔 犘分析 中确证为阳性的 产物用 犞 狊 狆 、 犛 狊 狆 限制性内切酶进行酶切。 犞 狊 狆 限制性内切酶 的反应体系为： ， ， ， 犞 狊 狆 酶 ， 第二轮巢式 产物 ， 反应。 犛 狊 狆 限制性内切酶的反应体系为： ， ， 犛 狊 狆 酶 ， 第二轮巢式 产物 ， 反应。 犞 狊 狆、犛 狊 狆限制性内切酶酶切反应产物电泳检验 操作步骤同 。 结果表述 经 犞 狊 狆 酶酶切产物电泳分别得到 、 片断结果的， 报告检出微小隐孢子虫。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e
14、b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 经 犛 狊 狆 酶酶切产物电泳分别得到 、 、 片断结果的， 报告检出微小隐孢子虫。 经 犞 狊 狆 酶或 犛 狊 狆 酶酶切产物电泳未得到 、 或 、 、 片断结果 的， 报告未检出微小隐孢子虫。 废弃物处理和防止污染的措施 检验过程中防止交叉污染的措施按照附录的规定执行。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z
15、. n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犃 （ 规范性附录） 检测过程中防止交叉污染的措施 犃 抽样和制样过程 抽样和制样工具， 应清洗干净， 高压灭菌 ， 一套洁净工具限于一份样品使用。 存放样品的容器应该经过清洗、 高压， 或为一次性灭菌容器。 犃 检测过程 犃 实验室应分为样品制备区、 前 区、 区和后 区。将模板提取、 反应液配 制、 循环扩增及 产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“ 净区” 到“ 脏区” 单 向进行。 犃 实验过程中， 应穿戴实验服和手套， 手套要经常更换。各区要有专用实验服， 经常清洗。 犃 各区所有的试剂、 器材（ 尤其是移液器） 、 仪器都
16、应专用， 不得带出该区。 犃 所有溶液、 水、 耗材和器具要 ， 高压， 避免核酸和（ 或） 核酸酶污染。每种溶液应使 用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在 贮存的试剂中， 可加入 的叠氮钠。所有试 剂应该以大体积配制， 然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。 犃 模板或引物的离心管打开之前， 要短暂离心， 离心管不能用力崩开， 以免产生气溶胶。 犃 前 区中， 最好能在 操作箱中加入 反应各组分。 犃 实验前后， 实验室用紫外线消毒以破坏残留的 。 犃 可使用 和 系统控制污染。 犃 应遵循 操作的其他要求。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r
17、e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 犜 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 进出口食品中隐孢子虫检测方法 犘 犆 犚法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街 号 邮政编码： 网址 电话： 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷 印数 书号： 定价 元 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 国内外标准大全 如果你需要更多标准可以到 进行免费查 阅。 如果你购买的文档存在缺页、字迹模糊、乱码等情况，请大家 通过论坛消息与我联系。 豆丁网国内外标准下载地址 http:/