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1、收稿日期:2005_09_30 基金项目:广东省重点课题(2005B30101006) Supported by Key Research Project of Guangdong Province (2005B 30101006) 作者简介:马安德(1961_),男,在读博士研究生,副教授,电话:020_ 61648173,E_mail: 通讯作者:吴曙光,电话:020_61648530,E_mail: 一种新的蝮蛇蛇毒磷脂酶 P2 同源物的分离纯化及其对 Qep3B 细胞基因 谱的影响 马安德 1,吴少瑜2,张嘉杰2,李志琴2,徐 伟2,文晓芸2,余 乐2,吴曙光2(南方医科大学1 分析
2、测试中心,2药学 院,广东 广州510515) 摘要:目的 从中国蝮蛇蛇毒中分离纯化出一种新的磷脂酶P2(PRP2)同源物,并研究其对Qep3B细胞基因谱的影响。 方法 用S18反相高效液相层析从蛇毒粗毒中分离纯化出PRP2同源物,并检测其纯度。 用电喷雾质谱仪测定PRP2同 源物分子量。 体外培养Qep3B细胞,以139 !gTml PRP2同源物处理12 h,应用基因芯片检测基因表达的改变。 结果 从 蛇毒粗毒中分离纯化出一种新的PRP2同源物,纯度为97.2U,相对分子质量为13 900。139 !gTml PRP2同源物处理 Qep3B细胞12 h 后, 19个基因表达下调,20个基因
3、表达上调。 表达改变的基因按功能分主要为以下6类:细胞周期控 制和VPW损伤修复类、细胞调亡和衰老类信号转导分子和转录因子、细胞黏附类、血管生成类以及肿瘤细胞入侵和转 移类。 结论PRP2同源物作用于Qep3B细胞后,可影响细胞多种基因的表达,表达改变的基因主要参与肿瘤细胞的生 长和转移。 本研究为进一步深入研究PRP2对肿瘤细胞的作用机制提供线索和依据。 关键词:蛇毒,蝮蛇;PRP2同源物;Qep3B细胞;基因芯片 中图分类号:R996 文献标识码:P 文章编号:1673_4254(2006)01_0075_05 !“#$%$+-11/ XP Pn_de1Y Z Shao_yu2Y QPWG
4、 ia_jie2Y R hi_in2Y Zei2Y ZEW iao_yun2Y a Re2Y Z Shu_guang2 1nstrumental Pnalysis and Research SenterY 2School of Pharmacological SciencesY Southern Xedical niversityY Guangbhou 510515Y Shina 2?/(6 B: The genes of Hep3B cells exposed to 139 g/ml PLA2 homologue for 12 h and their measurement on the m
5、icroarray 图5 基因在芯片上的表达 Fig.5 Expression of genes on the mi roarray A: Control Hep3B cells. B: Hep3B cells with 139 g/ml PLA2 homologue exposure for 12 h 图3 组分5质谱图 Fig.3 Mass spe trometry of the fra tion 5 whi h has a relative mole ular mass of 13 900 as measured by Mi romass KL ProteinSequenceSimila
6、ritySpecies 5th fractionHLLQFRKMIKKMTKK(1_15)Agkistrodon PLA2HLLQFRKMIKKMTGK(1_15)14/15(93%) Agkistrodon PLA2HLLQFRKMIKKMTGK(1_15)14/15(93%) Gloydius blomhoffi PLA2HLLQFRKMIKKMTGK(17_31)14/15(93%) Trimeresurus 表1 蛇毒蛋白第5组分N端1_15个氨基酸与其他已知蛇毒 蛋白N端1_15个氨基酸序列的比较 Mab.1 Nomparison of the 15 amino a ids at t
7、he O_terminal between the 5th omponent and the Pnown proteins from snaPe venom 2.3 组分5N末端序列分析 组分5N末端序列分析结果为HLLQFRKMIKK MTKK, 通过GenBank的protein_protein BLAST软 件进行同源性分析,结果表明,组分5N端的15个氨 基酸与已知的其他蛇毒PLA2具有较高的同源性,见 表1,因此初步推测该组分为PLA2同源物。 2.4 PLA2同源物对Hep3B细胞基因谱的影响 选择的SuperArray基因芯片包括112个基因, 这些基因的名称与测定的数值见图4和
8、图5。 图中的 方块颜色越深,表示基因表达水平也越高。 在112个 基因中,表达下调的基因有19个,见表2,按基因功 能分为以下6 类( 1)细胞周期控制和DAN损伤修复 类,FANCB, Cyclin E1, p16INK4,CHK2;(2 )细胞调亡 和衰老类,Apaf_1, Bax, Bck_x;(3)信号转导分子和转 录因子类,IKBA, RasGAP, c_Src(4)细胞黏附类,I_ CAM_1, Integrin a1, LFA1b, Integrin a4;(5)血管生成 类, HGF, Tie_2, TNFA;(6)肿瘤细胞入侵和转移类, Collagenase_1, MMP
9、_2。 表达上调的基因有20个,见 表3,按基因功能也可分为以下6类(1)细胞周期控 制和DAN损伤修复类,p27Kip1;(2)细胞调亡和衰老 类, Bcl_2, CASPER, Fas;(3)信号转导分子和转录因 子类,c_Ets2, MEK1, p38MAPK, KBF1, p85 alpha;(4) 细胞黏附类,CD44, Integrin a6, Integrin aV;(5)血管生 成类, FGF2, IFNA1, ALK_5, TSP1, Thrombospondin2; (6)肿瘤细胞入侵和转移类,MTS1,PAI_2。 3 讨论 作者首次从中国蝮蛇蛇毒中分离提纯出一种 PLA
10、2同源物, 该蛋白组分N末端的15个氨基酸与 多种蛇毒分离出的PLA2的15个氨基酸具有93%的 同源性46,其区别在于N末端的第二个氨基酸,该蛋 白组分是K而不是G。 在分离提纯PLA2同源物的过程中,我们采用高 效液相C18反相硅胶制备柱一次性快速分离蛇毒粗 毒蛋白组分的方法。 现已报道的C18反相高效液相 的两步分离方法7是用相同的C18反相柱对蛇毒组 分进行重复两次纯化,其目的是第一次纯化得到低纯 第1期马安德,等.一种新的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的分离纯化及其对Hep3B细胞基因谱的影响77 Gene nameDescription Ratio(PLA2 homologue: con
11、trol) Bcl_2B_cell CLL11.480 CD44CD44 antigen5.139 P27Kip1Cyclin_dependent kinase inhibitor 1B9.451 Casper/FLIP CASP8 and FADD_like apoptosis regulator 4.947 C_ETs2 V_ETs erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2 2.229 FGF2Fibroblast growth factor 22.043 IFNA1Interferon, alpha 15.170 Integrin a6I
12、ntegrin, alpha 62.443 Integrin aVIntegrin, alpha V10.730 MEK1Mitogen_activated protein kinase 12.188 P38 MAPKMitogen_activated protein kinase 42.427 NCAMNeural cell adhesion molecular 17.717 KBF1 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B_cells 2.853 P85 alpha Phosphoinositide_3_ki
13、nase, regulatory subunit, polypeptide 1 5.400 MTS1S100 calcium binding protein A4942.600 PAI_2 Serine proteinase inhibitor, clade B, member 2 10.430 ALK_5/ ACVRLK4 Transforming growth factor, beta receptor 2.688 TSP1Thrombospondin 157.891 Thrombospondin2 Thrombospondin24.311 Fas/Apo_1/CD95 Tumor nec
14、rosis factor receptor superfamily, member 6 75.870 表3 PLA2同源物诱导上调的基因 Tab.3 ;?/_()*+,a-). *)/)0 1/ 2)334 5),0 a6-)( 789 :;. 3o6s an6 ?.s/l s Retro_ spective analysis of 52 patients with PJS admitted in Nanfang Hospital from 1980 to 2003 was conducted. Twenty_four pa_ tients were found to have family
15、history of PJS, who had a mean age of 19 years. In the PJS patients, the incidence of gastric polyps was 64.4%, colorectal polyps 76%, and small bowel polyps 95%. The number of polyps was above 50 in 19 of the 31 patients with gastric polyps, in 18 of the 38 patients with colorectal polyps, and in 8
16、 of the 19 patients with small bowel polyps. The pathology of the maority of the polyps (63w108) was characterized by hamartomas, and the incidence of malig_ nancy was 13.5% in the PJS patients. oncl/sions PJS can be classified according to family history and location, pathology, and number of the p
17、olyps. As most patients with over 50 polyps require surgical intervention, 50 polyps is recommended as the criteria for PJS classification. Endoscopic surgery may suffice for management of patients with fewer polyps (|50), while in patients with more polyps or small bowel polyps, open surgery combin
18、ed with intraoperative endoscopic surgery is recom_ mended. A.5 Bo46s: Peutz_Jeghers syndromewsurgery clinic classification 黑斑息肉综合征, 又称为Peutz_Jeghers综合征 (PJS),以胃肠道息肉、口唇粘膜与四肢末梢色素沉着 为特征。 本研究总结分析了本院自1980年2003年 确诊的52例PJS患者的临床资料, 探讨了PJS患者 的临床分类方法。 1 临床资料 1.1 一般情况 PJS患者52例, 男21例、 女31例。 发病年龄 236岁,平均年龄16岁。 其中,25例伴轻度贫血、17 例中重度贫血。36例患者行血清白蛋白检查,16例患 收稿日期:2005_04_09 作者简介:戴益琛(1964_),男,在读博士研究生,副主任医师,电话: 13600901827, E_mail: = 200626(1)? 南方医科大学学报(J South Me? zniv)79