三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究.pdf

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1、2 0 0 8 年6 月 第J 6 卷第3 期 中国实验动物学报 A C T AL t B O R A T O R I U MA N M A U SS C I E N T I AS I N I C A J u n e 2 0 0 8 V 0 1 1 6N o 3 4 “。8 哟 g 研究报告$ 妲 ：菏吩 矗、e 5 、缈 三种小型猪线粒体D N A 控制区的比较研究 岳敏1 ，李洪涛1 2 ，张建明1 ，李金泽1 ，王玉珏1 ，顾为望1 ( 1 南方医科大学实验动物中心，广州5 1 0 5 1 5 ；2 郑州大学实验动物中心，郑州4 5 0 0 5 2 ) 【摘要】 目的分析五指山小型猪、巴

2、马小型猪和贵州香猪线粒体D N A 控制区碱基序列，比较研究不同猪种 的遗传标志。方法应用P C R 技术分别对这三种小型猪的血液总D N A 样品中线粒体D N AD l o o p 区进行扩增，测 序比对。结果猪的线粒体D N AD 1 0 0 p 区分三个区域。I 区( 靠近5 端区域) 7 0 4b p ，五指山小型猪在此区共有6 个变异位点，通过6 个变异位点中归纳出3 个单倍体而巴马小型猪在此区有9 个变异位点，通过9 个变异位点归 纳出4 个单倍体贵州香猪在此区共有6 个变异位点，通过6 个变异位点归纳出3 个单倍体。区( 串联重复序列 区) 。五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪

3、序列相同。区( 靠近3 端区域) 三种小型猪的序列几乎相同。结论 五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪三种小型猪之间线粒体D N A 碱基序列变异位点较少，五指山小型猪和巴 马小型猪亲缘关系较近。 【关键词】五指山小型猪；巴马小型猪；贵州香猪；线粒体D N A 控制区；遗传标记 【中图分类号】R 3 3 2 【文献标识码】A 【文章编号】1 0 0 5 4 8 4 7 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 2 0 6 0 3 AC o m p a r a t i v eS t u d yo fM i t o c h o n d r i a lD N AC o n t r o lR e g i o

4、n si n T h r e eB r e e d so fM i n i a t u r eP i g s Y U Em i n 。，L IH u n g - t a o 。”，Z H A N GJ i a n r u i n g 。，L IJ i n 孢，W A N GY u j u e 。G UW e i w a n 9 1 ( 1 L a l ) o m t o r yA n i m a lC e n t r e ，S o u t h e r nM e d i c a lU n i v e r s i t y ，G u a n g z h o u5 1 0 5 1 5 ； 2 L a

5、b o r a t o r yA n i m a lC e n t e r ，Z h e n 鲥l o uU n i v e r s i t y ，Z h e n g z h o u4 5 0 0 5 2 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oa n a l y z et h em i t o c h o n d r i a lD N Ac o n t r o lr e g i o ns e q u e n c e si nW u z h i s h a nm i n i - p i g s ，B a m a m i n i a

6、 t u r ep i g sa n dG u i z h o ux i a n gp i g sa n dt Oe x p l o r et h e i rc y t o p l a s m i cD N Am a r k e r s M e t h o d sT h em t D N AD - l o o pr e g i o n si n W u z h i s h a nm i n i - p i g s ，B a m am i n i a t u r ep i g sa n dG u i z h o ux i a n gp i g sW a sa m p l i f i e da n

7、 ds e q u e n c e db yP C R a s s a y R e s u l t s T h eD - l o o pr e g i o no ft h em i n i p i g sW a sd i v i d e di n t o t h r e ea r e a s A r e a sI ，a7 0 4b ps e q u e n c ea t5 - e n do ft h eD - l o o p 。I nt h i sa r n a ， W u z h i s h a nm i n i p i g sh a d6p o l y m o r p h i cs i t

8、 e s 6p o l y m o r p h i cs i t e sd e d u c e d3h a p l o t y p e s ，B a m am i n i a t u r ep i g sh a d9p o l y m o r p h i c s i t e s 9p o l y m o r p h i cs i t e sd e d u c e d4h a p l o t y p e s G u i z h o ux i a n gp i g sh a d6p o l y m o r p h i es i t e s ，6p o l y m o r p h i cs i t

9、e sd e d u c e d3 h a p l o t y p e s A r e a s1 1 ，T h et a n d e mr e p e a ts e q u e n c ew h i c hW a sl o c a t e di nt h em i d d l eo fm t D N AD - l o o p ，w a si d e n t i c a li nt h et h r e e b r e e d so fm i n i p i g s A r e a s ，t h es e q u e n c ea t3 - e n do ft h eD l o o p ，w h

10、 i c hW a sv e r yc o n s e r v a t i v e ，e x h i b i t e dp a r t i c u l a r l yh i s h h o m o l o g yw i t ht h e 蛐er e g i o ni nt h et h r e eb r e e d so fm i n i a t u r ep i 铲C o n c l u s i o n s T h ep o l y m o r p h i s mo fm t D N AD - l o o pw i t h i nt h e t h r e eb r e e d so fm

11、i n i a t u r ep i g si sp o o r T h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i po fW u z h i s h a nm i n i p i g sa n dB a m am i n i a t u r ep i g si sv e r yc l o s e 【K e yw o r d s 】W u z h i s h a nm i n i p i g ；B a m am i n i a t u r ep i g s ；G u i z h o ux i a n gp i g s ；M i t o c h o n d r i

12、a lD N AD - l o o pr e g i o n ；G e n e t i c m a r k e r 线粒体D N A ( m i t o c h o n d r i a lD N A ，m t D N A ) ，存在 于细胞质线粒体基质中的闭合环状双链超螺旋 基金项目 广东省农业攻关计划( 编号：2 0 0 6 8 2 0 2 0 1 0 5 3 ) ；广 东省科研条件建设项目( 编号：2 0 0 6 8 6 0 1 0 1 0 5 9 ) 。 作者简介】岳敏，女，硕士研究生。研究方向：人类疾病动物 模型与比较医学y u e 8 2 s i n a c o r n 。0 2 0

13、 - 6 2 7 8 9 1 5 8 通讯作者】顾为望，男，南方医科大学实验动物中心，教授，博 士生导师，E - m a l l ：G m m l 0 0 1 6 3 mT e l ：0 2 06 1 6 4 8 0 4 3 D N A 分子，是独立于细胞核染色体外的基因组，具 有自我复制、转录和编码功能，为母系遗传，但同时 受核D N A 的控制。与核酸D N A 相比，线粒体 D N A 具有分子结构简单，以母性方式遗传，核苷酸 歧义大，进化速度快等特点。它的物理结构可以分 为编码区和非编码区，编码区有3 7 个基因。非编码 区即线粒体基因组的控制区，也称D 1 0 0 p 区。遗传 上是

14、高变区，控制线粒体D N A 的复制和转录幢一1 ， 也是动物基因组中进化最快的区域。可以用来鉴定 万方数据 中国实验动物学报2 0 0 8 年6 月第1 6 卷第3 期A c t aL a bA n i t aS e iS i n ，J u n e ，2 0 0 8 ，V o I 1 6 N o 32 0 7 种群的进化关系b 1 。而五指山小型猪、巴马小型猪 和贵州香猪作为常用的实验动物，有关D L o o p 区的 常见变异位点和单倍型的报道还尚未见到。本文意 在对这三种小型猪的线粒体D N A 控制区( m t D N A D 1 0 0 p 区) 进行比较分析，为我国猪品种资源的有

15、效保护和合理利用提供有价值的理论依据。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 样本：1 7 个五指山小型猪D N A 样品、7 个巴 马小型猪D N A 样品和2 2 个贵州香猪D N A 样品由 中国农业科学院畜牧兽医研究所李奎老师惠赠。 1 1 2 仪器：杭州博日科技有限公司T C X P G 基因 扩增仪。 1 1 3 试剂：血液基因组D N A 提取试剂盒；一管便 捷式P C R 试剂盒( T I A N G E N ) 等。 1 2 方法 1 2 1 血液基因组的提取、P C R 反应和P C R 产物测 序：采用血液基因组D N A 提取试剂盒提取基因组 D N A 。采用特异

16、引物直接从总基因组D N A 中得到 线粒体D 1 0 0 p 区。按照参照文献【6 1 设计特异引物， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：P 1 ( 1 5 3 8 0 1 5 3 9 8 ) ：5 A G A C T A A C T C C G C C A T C A G 37 ，P 2 ( 1 1 4 一1 3 2 ) ：57 C G c G G A T A C T I G C A T G T G T 3 。采用 一管便捷式P C R 试剂盒：2 P f uP C RM a s t e r M i x 进行 目的产物的扩增。反应条件：预变性9 4 5m i n ； 9 4 5 0S

17、 ，5 3 c | C5 0 6 0s 和7 2 2m i n ，3 5 循环；7 2 延伸7r a i n 后4 保存。P C R 产物进行1 的琼脂糖 凝胶电泳观察，得到目的条带。P C R 产物送上海生 工生物工程技术服务有限公司测序，得到三个猪种 的D 1 0 0 p 区的全序列。 1 2 2 数据处理和分析：应用M E G A 3 0 软件，进行 所测序列的编辑、比对，并经人工核查，确定变异位 点和单倍型。 2结果 2 1 基因组D N A 的提取及P C R 扩增 按方法1 2 提取基因组D N A ，扩增三种小型猪 的线粒体D N A 的D 1 0 0 p 区。P C R 扩增产

18、物长度应为 1 6 3 1b p ，实际扩增长度与其相符，电泳结果见图l 。 M 为相对分子质量标记D 2 0 0 0 ；1 5 五指山小型猪部分样品线粒体D 1 0 0 p 区扩增结果；6 1 0 巴马小型猪部分样品线粒体D 1 0 0 p 区扩增结果；1 1 1 5 贵州香猪部分样品线粒体D 1 0 0 p 区扩增结果。 图l 五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体D 1 0 0 p 区扩增产物的电泳结果( 1 琼脂糖胶) N o t e ：M D N An m r k e rD 2 0 0 0 ；1 5 W u z h i s h a nm i n i p i g s ；6 一1 0

19、B a m am i n i a t u r ep i g s ；1 1 1 5 G u i z h o ux i a n gp i g s 啦1T h ee l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t so fP C Ra m p l i f i c a t i o np t , o d u c t so fm t D N AD - l o o pi nW u z h i s h a nm i n i - p i 萨，B a m am i n i a t u r e p 睁a n dG u i z h o ux i a n gp i g s ( 1 l l

20、t g l t O g e l ) 2 2三种小型猪的线粒体D N A 的D - l o o p 区的结构 线粒体D N AD 1 0 0 p 区大致分三部分：靠近5 端 序列7 0 4b p ，为I 区；靠近3 端3 4 0b p ，为区；中段 的串连重复序列区为区。见图2 。 2 3 三种小型猪线粒体D N AD 1 0 0 p 区3 端和57 端 比对分析研究 经过比对分析，三种小型猪D 1 0 0 p 区3 端区 序列几乎相同，是m t D N A 区的保守区域。而57 端I 区有相对较多的变异位点。利用M E G A 3 0 软件将 所测1 7 头五指山小型猪，7 头巴马小型猪和2

21、2 头贵 州香猪的线粒体控制区I 区的序列进行处理。所得 变异位点及单倍型结果见表1 。五指山小型猪的D 1 0 0 pI 区共检测出6 个变异位点，其中以1 8 0 位点的 转换较为突出，这个位点是T 的占“7 l 。通过 万方数据 2 0 8中国实验动物学报2 0 0 8 年6 月第1 6 卷第3 期A c t aL a bA n i t aS c iS i n ，J u n e ，2 0 0 8 ，V 0 1 1 6 N o 3 这6 个变异位点归纳出3 个单倍型。巴马小型猪的 D 1 0 0 DI 区共检测出9 个变异位点，其中以1 8 0 、4 0 4 位点的转换较为突出，1 8 0

22、 这个位点为T 的占 7 1 4 3 。通过这9 个变异位点归纳出4 个单倍型。 贵州香猪的D 1 0 0 pI 区共检测出6 个变异位点，其 中以2 4 0 、4 0 4 、6 9 1 这三个位点的转换较为突出，这 三个位点同时为T 、T 、A 的占3 1 8 2 。通过这6 个 变异位点归纳出3 个单倍型。贵州香猪与大白猪有 一个共享单倍型，与五指山小型猪、巴马小型猪无共 享单倍型。三种小型猪的串联重复区与其他猪种一 样为1 5 2 9 个G T A C A C G T G C 重复片段的重复。 、5 C A A C C A A A A C C A T A A C G T G C 、一串连

23、重复区G T A C A C G T G C 一1 区( 7 0 4b p ) 一一I I 区( 1 5 2 9 片段) - 一区 ( 3 4 0b p ) 一 I 区为5 ，端，区为串连重复区。医再石i 丽为重复片段， 区为3 端 图2m t D N AD 1 0 0 p 区结构示意图 I ：Y - e n d ；1 1 ：t h et a n d e mr e p e a tm o t i fG T A C A C G T G C ；：Y - e n d F i g 2 T h es k e t c hs t r u c t u r em a po fm t D l o o pr e g

24、i o n 表1三种小型猪的线粒体控制区5 端的变异位点和 单倍型 T a b 1V a r i a b l es i t e sa n dh a p l o t y p e so f5 - e n do fm t D N AD l o o pr e g i o ni nt h et h r e eb r e e d so fm i n i - p i g s 譬品：案鬟管堂竺竺竺竺型兰生 掣。酬m a n b e r1 8 02 4 0 2 6 62 7 83 3 5 4 0 44 5 15 0 0 5 5 26 3 96 5 86 6 0 6 9 1 w h 孟 。ct。at。8。 g b

25、 m 71 8 t g a g z x l 2 27tta 乎x 2 1 4 鲤! !：! ：! E ! ： 上方数字表示变异位点的位置；( ) 表示与大白猪有相同的碱基组 成( 大白猪线粒体D N AD 1 0 0 p 区的基因序列参考G e I l B a n k ) ；W a s ：五 指山小型猪；b i n ：巴马小型猪；g s x ：贵州香猪 N o t e ：T h eu p p e rn u m b e mc o r r e s p o n dt ot h ep o s i t i o n so fv a r i a b l es i t e s Ad o t ( ) i n d

26、 i c a t e si d e n d i t yw i t hk 伊w h i t ep i g ss e q u e n c e s W z s ：W u z h i s h a n m i n i p i g s ；b ：B a m am i n i a t u r ep i g s ；g s x ：G u i z h o uI i 且n gp i 伊 3 讨论 线粒体D N A 结构简单、稳定、是母性遗传方式， 在世代传递过程中没有重组，与父本遗传物质无关。 线粒体D N A 的研究可用于探讨猪种起源进化、对杂 交形成的种群的遗传背景提供更可靠、更科学的证 据心】。本文通过对三种小

27、型猪线粒体D N AD 1 0 0 p 区测序，证实三种小型猪串联重复片段是与其他猪 种相同，但重复片段的重复次数不同，1 5 2 9 次不 等。此结构也存在于兔、马、海狗、山羊、绵羊以及猫 等哺乳动物的D l o o p 区序列中，其功能还不完全清 楚引。 前人研究表明通过线粒体D N AD 1 0 0 p 区全序 列的测序和比对研究，可以进行猪的品种鉴定，而且 方法简便，成本低廉油o 。但本研究发现五指山小型 猪、巴马小型猪和贵州香猪变异位点较少，串联重复 区序列相同。三种小型猪之间线粒体D N A 多态性 贫乏，所以应用P C R 直接测序分析，尚不能作为三 种实验用小型猪品种、品系鉴定

28、的依据，遗传标志也 不能确定。是这三种小型猪血缘关系较近还是样本 量过少的原因所致，有待于进一步研究。本研究结 果与李馨等 ，付艳艳等归1 先后所做的三江白猪、西 藏小型猪线粒体D N A 的多态性分析所得的结论相 一致。从外表看三种猪的特征差别明显，但它们的 m t D N A 在遗传结构上没有太大的差别，这也反映了 它们母系起源上的一致性。它们可能是一个共同的 野生祖先，而不同猪种是由于长期的驯养驯化的制 约，而形成了形态及生态特征的不同。在测序比对 中五指山小型猪的3 个单倍型是巴马小型猪的共享 单倍型，说明这两者的亲缘关系较近，可能与地理位 置较近( 海峡之隔) 有关系。 参考文献 1

29、 曹宏卿，顾为望F M M U 白化豚鼠线粒体D N AR F L P 分析研究 J 中国实验动物学报，2 0 0 5 ，1 3 ( 4 ) ：2 4 2 2 4 5 2 张亚平，施立明动物线粒体D N A 多态性的研究概论 J 动 物学研究，1 9 9 2 1 3 ( 3 ) ：2 8 9 2 9 8 3 王存芳，曾勇庆，杜立新猪线粒体D N A ( m t D N A ) 及其在遗 传育种中的应用 J 黑龙江畜牧兽医，2 0 0 1 ，9 ：5 7 4 杨隽线粒体D N A 多态性与家畜遗传育种L J I lJ t l 畜牧兽 医。2 0 0 1 。l ：3 2 3 3 5 赵兴渡，李宁，

30、吴常信猪线粒体D N AD 1 0 0 p 的遗传变异分 析 J 遗传，1 9 9 7 ，1 9 ：2 3 2 6 6 刘中禄，魏泓曾养志，等中国三种实验用小型猪m t D N A D 1 0 0 p 多态性分析 J 动物学，2 0 0 1 ，4 7 ( 4 ) ：4 2 5 4 3 0 7 W a t a n a b eT ，H a y n s h lY ，K i m u r aJ e ta 1 P i gm i t o e h o n d 划D N A p o l y m m p h i s m 。r e s t r i c t i o nm a po r i e n t a t i u na n dM q u e i l O ed a t a J B i o o h e mG e n e t ，1 9 8 6 ，2 4 ：3 8 5 3 9 6 8 李孽，杨隽三江白猪线粒体D N A 的多态性 J 动物学杂志， 2 0 0 3 ，3 8 ( 5 ) ：4 1 4 4 9 付艳艳，顾为望刘运忠，等西藏小型猪线粒体D l o o p 区及徽 卫星多态性的遗传学分析 J 中国实验动物学报。2 0 0 6 1 4 ( 4 ) ：3 1 8 3 2 1 收稿日期】2 0 0 8 - 0 1 1 4 万方数据