不同类型急性白血病患者骨髓间充质干细胞的病理学特征.pdf

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1、2 5 7 4 中华医学杂志2 0 0 6年9月2 6日8 6卷第 3 6期N a t l M e d J C h i n a , S e p t e m b e r 2 6 , 2 0 0 6 , V o l 8 6 , N o . 3 6 a n t i g e n D . A r z t l L a b , 1 9 7 7 , 2 3 : 4 7 6 1 1 7 9 2 L a c e y P A , C a s k e y C R , W e rn e r D J , e t a l . F a t a l h e m o l y t i c d i s e a s e o f a n

2、 e w b o rn d u e t o a n t i - D i n a n R h - p o s i t i v e D U v a r ia n t m o t h e r . T r a n s f u s i o n , 1 9 8 3 ， 2 3 : 9 1 一 6 . 3 D a n ie l s G . H u m a n b l o o d g r o u p s . 2 n d e d . B l a c k w e ll S c i e n c e L t d , 2 0 0 2: 2 0 8 4 Wa g n e r F F , G a s s n e r C ,

3、 M u l l e r T H, e t a l . T h r e e M o l e c u l a r S t r u c t u r e s C a u s e R h e s u s D C a t e g o ry V I P h e n o t y p e s Wi t h D i s t i n c t I m m u n o h e m a to l o g i c F e a t u r e s . B l o o d , 1 9 9 8 ， 9 1 ; 2 1 5 7 - 2 1 6 8 . 5吴俊杰， 洪小珍， 许先国， 等 中国人R h 部分D表型的分子机 理研究.

4、 中国 实验血 液学杂志， 2 0 0 6 , 1 4 ; 5 8 7 - 5 9 1 . 6 L e g l e r T J , M a a s J H , K o h l e r M, e t a l . R H D s e q u e n c i n g ; a n e w t o o l fo r d e c is io n m a k in g 。 。tr a n s fu s i o n th e r a p y h a n d p r o v i s io n o f R h p r o p h y l a x i s . T r a n s f u s io n M e d i

5、 c i n e , 2 0 0 1 ， 1 1 : 3 8 3 - 3 8 8 . 7 M a a s k a n t - v a n W ij k P A , F a a s B H W, d e R p ij t e r J A M, e t a l . G e n o t y p i n g o f R H D b y m u l t i p l e x p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a n a ly s i s o f s ix R H D - s p e c i fi c e x o n s . T r a n s f

6、u s i o n , 1 9 9 8 ， 3 8 : 1 0 1 5 - 1 0 2 1 8 G a s s n e r C , S c h m a r d a A , K i l g a - N o g l e r S , e t a l . R H D / C E t y p i n g b y p o l y m e r a s e c h a n i n r e a c i t o n u s i n g s e q u e n c i - s p e c i fi c p r im e r s . T r a n s f u s i o n , 1 9 9 7 ， 3 7 : 1

7、0 2 0 - 1 0 2 6 . 9邵超鹏， 熊文. 一种新的R H D合子型直接测定方法.中华医学 杂志， 2 0 0 4 , 8 4 : 7 3 6 - 7 3 9 . 1 0 G a s s n e r C , D o e s c h e r A, D rn o v s e k T D, e t a l . P r e s e n c e o f R H D i n s e ro l o g i c a ll y D - , C / E+i n d iv i d u a l s ; a E u ro p e a n m u l t i c e n t e r s t u d y . T

8、 r a n s f u s i o n , 2 0 0 5 ， 4 5 ; 5 2 7 - 5 3 8 . 1 1 P o u l t e r M, K e m p T J , C a r r it t B , e t a l . D N A b a s e d R h e s u s t y p in g ; s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f R H C a n d R H D s t a t u s u s in g t h e p o l y m e r a s e c h a in r e a c i t o

9、n . V o x s a n g u i n i s， 1 9 9 6 , 7 0 : 1 6 4 - 1 6 8 1 2 P e r c o P , S h a o C P , M a y r WR , e t a l . T e s t i n g f o r t h e D z y g o s i ty w i t h t h r e e d i ff e r e n t me t h o d s r e v e a l e d a l t e r e d R h e s u s b o x e s a n d a n e w w e a k D t y p e . T r a n s

10、 f u s i o n , 2 0 0 3 ， 4 3 : 3 3 5 - 3 3 9 . 1 3 K e m p T J , P o u l t e r M, C a r r i t t B . A r e c o m b i n a t i o n h o t s p o t in t h e R h g e n e s r e v e a l e d b y a n a l y s i s o f u n r e l a t e d d o n o r s w i t h t h e r a r e D - p h e n o t y p e . A m J H u m G e n e

11、 t , 1 9 9 6 , 5 9 : 1 0 6 6 - 1 0 7 3 . 1 4 M a a s k a n t - v a n W ij k P A , F a a s B H W, B e c k e r s E A M, e t a l . E v i d e n c e t h a t t h e R H D A d e l e t i o n g e n o t y p e d o e s n o t e x i s t . B l o o d , 1 9 9 7 ， 9 0 : 1 7 0 9 - 1 7 2 0 . 1 5昊俊杰， 洪小珍， 许先国， 等. R H D基因

12、测序方法的建立及其在 弱D表型分子鉴定中的应用. 中 华检验医学杂志， 2 0 0 6 , 2 9 : 4 6 0 - 4 6 2 . 1 6昊俊杰， 许先国， 洪小珍， 等一 例R h D弱表达突变体的血清学和 分子生物学研究. 中 华医学杂志， 2 0 0 5 , 8 5 . 1 6 3 8 - 1 6 4 0 . ( 收稿日 期: 2 0 0 6 -0 1 - 1 1 ) ( 本文编辑: 苗蔚) 不同类型急性白血病患者骨髓间充质干细胞的病理学特征 赵智刚 袁文素葛薇 唐晓琼王红祥李秋柏吕建陈智超邹萍 骨髓间充质干细胞( M S C ) 具有在体内和体外 支持造血的功能， 因 此联合M S

13、 C的造血干细胞移植 有可能增强移植效果， 最近研究结果证实联合 M S C 的造血干细胞移植可以 促进造血干细胞的植人和造 血恢复 ，“ 习 。 既往研究发现急性白 血病患者骨髓造 血微环境存在病理改变， 包括细胞的组成和功能改 变。但是， 急性白血病患者骨髓M S C 是否受到影响 以及影响程度， 尚不清楚。此外， M S C的来源有限， 而且异基因M S C 存在归巢效率低等问题。因此， 本 研究获取急性白血病患者自 体的骨髓 M S C ， 采用低 血清培养基培养和扩增， 观察其体外增殖能力、 多向 分化和支持造血功能， 以明确其生物学性状并为自 体M S C 在临床中的进一步应用提供

14、详尽的实验 依据。 一、 对象与方法 1 . 对象: 1 5 例急性髓性白血病 ( a c u t e m y e l o i d 作者单位: 4 3 0 0 2 2 武汉， 华中科技大学同济医学院附属协和医 院血液科( 赵智刚、 唐晓琼、 王红祥、 李秋柏、 吕 建、 陈智超、 邹萍) ; 中 国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所 实验血液学国家重 点实验室( 袁文素、 葛薇) 通讯作者: 邹萍， E m a i l : z o u p i n g p u b l i c . w h . h b . e n l e u k e m i a , A M L ) 患者， 年龄2 6 一 5

15、7 岁， 中位年龄3 3 岁; 1 2 例急性淋巴细胞白血病( a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a , A L L ) 患者， 年龄 1 9 一 4 3 岁， 中位年龄2 9 岁; 均为华中 科技大学同济医学院附属协和医院住 院病例。根据M I C 分类标准， 1 5 例A M L 患者中: 2 例M 1 ， 6 例 M 2 , 2 例 M 3 , 3 例 M 4 , 2例 M 5 ; 1 2 例 A L L 患者中4 例L 1 , 8 例L 2 。所有A M L 和A L L 患 者均为初治病人。8 例正常人作为对照， 年龄

16、 巧- 3 5 岁， 中位年龄 2 6岁。本研究经本院伦理委员会 同意， 上述标本提供者均签署知情同意书。 2 . 细胞增殖能力分析: 参照文献方法获取白血 病患者和正常人骨髓M S C “ 。 5 x 1 0 ， 细胞接种于 2 4 孔板中， 每隔1 d 取3 孔细胞进行计数， 计算均 值， 绘制生长曲线。 3 . 免疫表型分析: 胰酶消化A L L 骨髓 M S c ， 应 用间标法用流氏细胞仪检测 M S c的表面抗原: C D 1 4 ， C D 2 9 、 C D 3 1 、 C D 3 4 , C D 4 4 、 C D 4 5 、 C D 1 0 5和 H L A - D R抗体

17、( P h a r M in g e n公司) 。不同代数的 M S c的免疫表型被检测和分析。应用免疫组织化 学方法检测 A M L 骨髓 M S c ， 具体步骤参照S P 9 0 0 0 试剂盒说明书进行。 中华医学杂志2 0 0 6年9 月2 6日第 8 6卷第 3 6 期N a t l M e d J C h i n a , S e p t e m b e r 2 6 , 2 0 0 6 , V o l 8 6 , N o . 3 6 2 5 7 5 4 . 体外诱导多向分化: 成骨诱导: 5 X 1 0 4 细胞 接种于6 孔板中， 加人含I X 1 0 一 m o l/ L 地塞

18、米松、 1 0 m m o l/ L (3 磷酸甘油、 0 . 0 5 m m o U L维生素 C和 1 0 %胎牛血清( F C S ) 的 D M E M培养基， 2周后 V o n K o s s a 染色检测钙化小结; 脂肪诱导: 5 X 1 0 4 细胞接 种于6 孔板中， 加人含1 0 - 6 m o U L 地塞米松、 0 . 5 m m o l/ L 1 一 甲基一 3 一 异丁基一 黄嘿吟( S i g m a 公司) 0 . 1 m m o U L 维生素C和1 0 % F C S 的I M D M培养基， 7d 后油红0染色检测脂肪滴。 5 . 支持造血功能的分析: R

19、 T - P C R检测造血因 子的表达: 干细胞因子( S C F ) ， 粒细胞集落刺激因 子( G - C S F ) ,粒、 巨噬细胞集落刺激因子 ( G M - C S F ) ， 巨噬细胞集落刺激因子( M - C S F ) ， 白介素3 ( 1 L - 3 ) ，白介素 6 ( I L - 6 )， 促血小板生长因子 ( T P O ) 。管家基因三磷酸甘油醛脱氢酶( G A P D H ) 作为内对照， 引物序列、 扩增片断长度和退火温度见 表1 。 将骨髓M S c 用6 0 C o y 照射1 0 . O G y ， 然后接 表1 P C R引物序列、 扩增片断长度和退火

20、温度 引物序列( 5 - -, 3 ) 扩增片断 退火 长度温度 ( b p )( ) 贴壁细胞存在， 但是几乎不增殖， 最终未能培养出可 以 传代的M S C ; 另外 1 例( L 2 ) 经过2 周培养， 没有 贴壁细胞出现。A L L 骨髓MSc形态为梭形， 核仁明 显。A L L 来源的MSc在体外增殖能力强， 其倍增时 间约为5 0 h ， 细胞的形态和倍增时间随着细胞的传 代变化不大。此外， A L L来源的MSc表达C D 2 9 , C D 4 4 , C D 1 0 5 ， 不表达 C D 3 4 , C D 4 5 , C D 3 1 , C D 1 4和 H L A -

21、 D R 。 该免疫表型随着细胞传代变化不大。 另外， 我们从1 0 例A M L 患者骨髓中分离培养 出MSc 。另外5 例( 1 例 M l , 2 例M 2 , 1 例 M 4 , 1 例M 5 ) 的骨髓单个核细胞经过2 周培养， 没有贴壁 细胞出现。A M L 骨髓 MSc在体外增殖能力差， 不 能连续培养2 代以上。应用免疫组化检测该细胞群 体的表型， 结果显示该细胞群体表达 C D 2 9和 C D 4 4 ， 其他表面标志均为阴 性。 2 . 多系分化的鉴定: A L L 骨髓 MSc在成骨诱导 3 周后， 细胞呈现多层生长的结节状， 并有大量钙盐 沉 积， V o n k o

22、 s s 。 染 色 证实 为 钙 盐 沉 积 1。 在 成 脂肪 分 化体系中诱导 1 周后可以看见大部分细胞胞体变 大， 胞质出现大量脂肪滴， 油红 0染色证实为脂肪 滴。但是， A M L 骨髓来源的M S C ( n = 3 ) 在诱导培养 过程中， 细胞逐渐死亡; 其他标本( n = 5 ) 经过诱导 后， 细胞在形态上没有改变， V o n K o s s a 和油红0 染 色也为阴性。 3 . 体外支持造血能力: A L L ( n = 6 ) 和A M L ( n 二 3 ) 骨髓 M S c表达 S C F ， I L - 6 ， G - C S F ， G M - C S

23、F和 M - C S F ， 不表达I L - 3 和T P O o A L L 骨髓 M S C ( n = 8 ) 具 有促进红系祖细胞( B F U - E ) , 粒/ 巨噬系祖细胞 ( C F U - G M ) 和混合集落( C F U - G E M M ; 由粒细胞、 巨 噬细胞、 巨核细胞和有核红细胞共同组成， 属更早 期的造血祖细胞) 增殖的能力( 图1 ) 。但是， A M L 骨髓基质细胞( n二 3 ) 不具有体外长期支持造血 0000 6J呀，山0 ，火1五，立孟 6060606060606055 、U 一了4 ，八 84314774 内j台八、J.1 了内j 34

24、21 S C F 5 C C A TT G A T 0 0 0 TT C A AG G A C 3 5 C TT C C A G T A T A A G G C T C C A A 3 G - C S F 5 A G C TT C C T G C T C A A G T G C TT A G A G 3 5 TT C TT C C A T C T G C T G C C A G A T G G T 3 G M- C S F 5 C T G C A C C C 0 0 0 C G C T C G 3 5 C A C T C C T G G A C T G G C T C 3 M- C S F 5

25、 T G A G A G G C AG T C C G A G G G A U 5 G A A TT 0 0 0 T C T A C A C T G G C A 3 I L - 3 5 A A C A C A C TT A A A G C A 0 0 0 A C 3 5 TT T A C A G A A C G C A T C A G C A A 3 I L -6 5 G T A0 0 0 G C C C C A C AC A G A C A G C C 3 5 G C C A T C T TT G G A A G G TT C A G G 3 T P O 5 G T A G G G G T

26、G G 0 0 0 TT G G A G C A G 3 5 A A G T 0 0 0 A G C A G G G A TT C A G A G C 3 G A P D H 5 T A T G A T G A C A T C A A G A A G G T G G 3 5 C A C A A C C C T G TT G C T G T A 3 留导娜专璐招牵乙1常被礁 种于长期培养基( M y e l o C u l t H 5 1 0 0 , 1 x 1 0 一 m o l/ 1 氢化考的松) 中。获取健康人骨髓单个核细胞， 预 先培养4h以去除贴壁细胞， 将悬浮细胞按照 1 x 1 0

27、 6 / m l 接种在照射后的M S c中， 在3 7 C , 5 % C O , 中培养， 每周半量换液。 4周后获取全部细胞接种 于甲 基纤维素体系中测定其集落形成能力。 二、 结果 1 . MSc形态学特点和免疫表型: 从9 例A L L 患 者骨髓中培养出M S c ， 另外3 例的骨髓单个核细胞 经过2周培养， 其中2例( 1 例 L 1 , 1 例 L 2 ) 有少量 粒/巨 集落 形成单位 棍合集落 形成单位 00IICO 8夕b月，内适 图1 正常成人骨髓 M S c 和 A L L 骨髓 M S c支持造血作用 2 5 7 6 作用。 三、 讨论 本研究获取并分析了A M

28、L和A L L骨髓来源 M S c的生物学特征， 同时获取正常成人骨髓M S c作 为对照。我们的结果显示A L L 骨髓M S c 具有以下 特征: ( 1 ) 该细胞在形态上表现为梭形; ( 2 ) 表达与 支持造血有关的豁附分子， 如C D 2 9 , C D 4 4 ; 不表达 内 皮和造血细胞的 标志， 如C D 3 1 , C D 3 4 , C D 4 5 ; 而 且， A L L骨髓 M S c还表达 C D 1 0 5 ， 这与文献报道 M S c 的 免 疫表型 是 一致的4 1 0 ( 3 ) 在相 应的 诱导体 系中， 可以向骨和脂肪分化， 这说明 其具有多系分化 能力

29、。( 4 ) 可以在体外大量扩增， A L L 骨髓M S c可 以在体外连续培养1 0 代以上。( 5 ) 支持造血作用: A L L 骨髓M S c 表达造血相关的细胞因子， 进一步通 过半固体集落形成实验发现其具有体外维持长期培 养起始细胞的能力。此外， 我们同时获取了正常成 人骨髓M S c 作为对照， 以进一步明确急性白血病骨 髓M S c的生物学特征。结果显示A L L 骨髓M S c和 正常骨髓M S c 具有相似的形态学和生长特点， 免疫 表形、 体外分化和支持造血能力。由 此可见， 在A L L 骨髓中存在一类具有M S c特性的细胞群体。 但是， A M L 骨髓M S c

30、存在病理性改变， 主要表 现为增殖、 分化能力和支持造血异常。在本研究中， A M L 骨髓M S c在体外的增殖能力差， 不能连续传 代培养 2代以上， 而且丧失多向分化能力， 在以 A M L 骨髓M S c为滋养层的长期培养体系中培养4 周后， 不能在甲基纤维素培养体系中形成集落。此 外， A M L 骨髓M S c和A L L 骨髓 M S c具有类似的免 疫表型， 但是却不表达C D 1 0 5 。导致A M L 骨髓M S c 发生病变的可能因素有以下几种: ( 1 ) 异常的巨噬 细胞。巨噬细胞来源于骨髓中的单核细胞， 而在髓 性白血病中 存在单核细胞恶性克隆， 因此巨噬细胞 可

31、能同 样恶性变， 从而影响骨髓M S c 。既往研究发 现在C M L 骨髓中存在恶性巨噬细胞， 从而影响骨髓 基质细胞的生物学特性， 当去除C D 1 4阳性的恶性 巨噬细胞后， 骨髓基质细胞表现为正常的生物学特 性 5 1 0 ( 2 ) 异常的细胞因子。既往研究显示A M L 骨髓中M S C 数量减少， 同时发现M - G S F 含量下降。 进 一 步 研 究 显 示 二 者 之间 存在明 显 相关 性 “ 。( 3 ) A M L 骨髓中的白血病细胞克隆和 M S C之间的相互 作用， 从而影响M S C的生物学特性。 参考文献 1 K o c O N , G e r s o n

32、S L , C o o p e r B W, e t a l . R a p i d h e m a t o p o ie t ic re c o v e r y a f t e r c o i n f u s i o n o f a u t o l o g o u s - b l o o d s t e m c e ll s a n d c u l t u r e - e x p a n d e d m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e ll s i n a d v a n c e d b r e a s t c a n c e r p

33、a t i e n t s re c e iv i n g h i g h - d o s e c h e m o t h e r a p y . J C l i n O n c o l , 2 0 0 0 , 1 8 : 3 0 7 一1 6 . 2 N o o rt W A , K r u i s s e l b r i n k A B , i n t A n k e r P S , e t a l . M e s e n c h y m a l s t e m c e ll s p ro m o t e e n g r a f t m e n t o f h u m a n u m b

34、il i c a l c o r d b l o o d - d e r i v e d C D 3 4( + ) c e ll s i n N O D / S C I D m i c e . E x p H e m a t o l , 2 0 0 2 , 3 0 : 8 7 0 - 8 7 8 . 3赵智刚， 唐晓琼， 李静， 等. 慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细 胞的分离纯化及其功能特性研究. 中 华医学杂志， 2 0 0 5 , 8 5 ; 2 0 5 4 - 2 0 5 7 . 4 P e t t e n g e r M F , M a c k a y A M, B e c k S

35、C , e t a l . M u l t i l i n e a g e p o t e n t i a l o f a d u l t h u m a n m e s e n c h y m a l s t e m c e ll s . S c i e n c e , 1 9 9 9 , 2 8 4 : 1 4 3 - 1 4 7 . 5 R h a t i a R , M c G l a v e P B , D e w a l d G W, e t a l . A b n o r m a l f u n c t i o n o f t h e b o n e m a r ro w m i

36、 c r o e n v i ro n m e n t i n c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a ; ro l e o f m a l i g n a n t s t r o m a l m a c r o p h a g e s . B l o o d , 1 9 9 5 ， 8 5 : 3 6 3 6 - 3 6 4 5 . 6 M a y a n i H . C o m p o s i t i o n a n d f u n c t io n o f t h e h e m a t o p o i e t i c m

37、i c r o e n v iro n m e n t in h u m a n m y e l o i d l e u k e m i a . L e u k e m i a , 1 9 9 6 , 1 0 : 1 0 4 1 - 1 0 4 7 . ( 收稿日 期: 2 0 0 6 -0 8 - 2 5 ) ( 本文编辑: 苗蔚) . 读 者 作 者 编 者 本刊有关文稿中法定计量单位的书写要求 本刊法定计量单位具体使用参照1 9 9 1 年中华医学会编 辑出版部编辑的 法定计量单位在医学上的应用 一书。注 意 单 位 名 称 与 单 位 符 号 不可 混 合 使 用， 如n g k g

38、一 天一 应 改为n g k g - 1 d - 1 ; 组合单位符号中 表示相除的 斜线多于 1 条时， 应采用负数幂的形式表示， 如n 盯k 酬m i n 应采用 n g “ k g - m i n 的 形式; 组合单位中 斜线和负数幂亦不可 混用， 如前例不宜采用n g / k g “ m i n - 的 形式。 在首次出现不 常用的法定计量单位处用括号加注与旧 制单位的换算系数， 下文再出现时只列法定计量单位。人体及动物体内的压力 单位使用m m H g 或c m H 2 O ， 但文中首次出现时用括号加注 ( 1 m m H g = 0 . 1 3 3 k P a ) 。 正文中时间的 表达， 凡前面带有具 体数据者应采用d , h , m i n , s ， 而不用天、 小时、 分钟、 秒。量的 符号一律用斜体字母。