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1、中国 输血杂志2 0 0 6 年第1 9 卷增刊( 中国 输血协令节四月 箱血大会)3 S 二 :必台分翘沮台 、号 湘I I 丙型肝炎病毒的基因分型和分子进化研究 付涌水曾四海江朝富 ( 广州血液中心， 广东广州 5 1 0 0 9 5 ) 丙型肝炎是由 丙型肝 炎病毒( h e p a t i t i s C v i r u s , H C V ) 所引起的一种主要经血源传播的 传染病， 迄今为 止， 全世界已 有约1 亿7 仟万人 感染了H C V , 其中 绝大多数为慢性感染, 2 0 %- v 3 0 %的感染者经过1 0 2 0 年的 慢性活动性肝炎 后发 展成肝硬化、 甚至肝癌(
2、 H e p a t o c e l l u l a r C a r c i n o m a , H C Q C l 。目 前对于 丙型肝炎 的治疗仍无特效方法， 单用干扰素或用干扰素联合 R i b a v i r i n 治疗总体疗效较差， 且不同的 HC V基因型或 亚型 对干扰素治疗效果、 地理分布和 传播模式不尽相同。 为了 解H C V的分子特征， 笔者对1 3 6 株H C V部 分基因 进行了扩增、 基因 分型和分子 进化研究。 1 材料与方法 1 . 1 标本来源1 4 4 份H C V R N A阳性的 血液标本来自我国的沈阳、 北京、 内 蒙、 上海、 郑州、 广州、 深
3、圳、 佛山、 昆明 等省市， 为2 0 0 2 年 广州达安基因诊断中心、 广州金域诊断中 心及广州血液中心收集的标 本。 1 . 2 P C R引物 根据已发表的H C V基因序列， 以5 MR, C o r e 区基因为靶基因设计扩增6 种不同的基 因型的 P C R扩增引物， 核昔酸序列如表 1 所示。表中的位置为在HC V - 1中的核昔酸位置。 表 1 P C R引物 区域名称引物序列( 5 - 3 )位置用处 5 UT R F 1 5 C T G T G AG G AAC T AC T G T C T 4 5 - 6 3 A 3 2 9 T G G TG C A C G G T C
4、 TA C G AG A C 3 2 3 - 3 4 2外引物 F 1 3 GAA A GC G “ I U TA G C C AT G G C G T 7 1 - - 9 1 A 2 9 5 C AA G C A C C C T A TC AG G C AU1 2 8 8 - y 3 0 7内引物 C o r e C l A G GC C TT G T G G TA C T G C C T G AT A 2 7 6 - 2 9 8 C 2 G T AT G T AC C C C A C G A GG T C G G C 7 3 6 - 7 5 7外引物 C 3 C G G G AG G T
5、C T C GT A GA C C G T 3 1 7 - - 3 3 6 C 4 A G GG T A TC GA T G AC C T T A C C C A 6 9 8 - - 7 1 8内引物 1 . 3 R N A提 取和 逆转录一 套式聚合酶 链反应 将 1 0 0 户血浆加 人 l m l 的T r i - p u re ( R o c h e 公司) 中， 按说明 书提取病毒的总R N A ， 以随机引物 将之逆转录成c D N A 。用5 U T R区的引物对所有标本进行 H C V R N A 筛选, P C R阳性的再用所设计的C o r e 区引物进行扩增。扩增C o
6、r e 区基因的第一次P C R条件为9 4 0C 5 mi n ， 然后进人循环: 9 4 C 4 0 x , 5 0 0C 4 0 x , 7 2 0C 4 0 s ， 共3 0 循环; 第二次 P C R条件为 9 4 0C 5 m i n ， 然后进人循 环: 9 4 C 4 0 s , 5 4 C 4 0 x , 7 2 C 4 0 s ， 共3 0 循环; 扩增 产物于1 . 5 %的琼 脂糖凝胶电 泳初步鉴定， 符合预期分子 量大小的P C R 产物进行测序。 1 . 4 核昔酸序 列测 定以Q 工 A q u i c k P C R 产物纯化试剂盒( Q I A G E N公司
7、) 对P C R产物进行纯化， 紫外分 光光度计定量后用特异性引物和A B I 公司的测序 试剂盒对P C R 产物进行双向测序。 测序结果用D N A s t a r 软件中的S e q m a n 软 件进行核对。 1 . 5 分子进化树的 构建和基因 分型 从H C V资料库中( h t t p : / / h c v . l a n l . g o v ) 分别选取代表性的H C V 基因型和亚型的 C o r e区基因 1 - 2 个和所测定 的 H C V C o r e区基因序列进行比较( a l i g n me n t ) ， 然后用 3 6中 国输血杂志2 0 0 6 年第
8、1 9 卷增 刊( 中. 榆血协会常四 月物血大会) M E G A 2 软件( w w w . m e g a s o f t w a r e . n e t ) 的K i m u r a 两 参数方法中的N e ig h b o r - j o i n i n g 法构建进化树和计算 核昔酸序列之间的遗传距离， 并根据进化树对所测定的基因进行基因型和亚型的鉴定。 2结果 2 . 1 R T - P C R 1 4 4 份用H C V 5 U T R区引 物扩增阳 性的标 本， 用H C V C o r e 区引物扩 增时1 3 6 份阳性。 2 . 2 分子 进化树的 构建 从H C V资
9、料库中 分别选取C o r e 区不同基因型和亚型的核昔酸序列1 .2 个与 所测定的H C V C o r e 区 基因 序列进行比 较并构建分子 进化树。 2 . 3 H C V的 基因 分型 结果如表2 所示， 其中表中的6 型中 的新亚型 是指根据测序结果， 可将该序列分为 6型， 但不能归为任一已发现的亚型。 表2 H C V核心区基因 分型 结果 基因分型数目百分比( %) 1 a 2 1 _ 4 77 9197衬74 6613众氏 9429 1 . 4 7 6型中新亚型 合 计 :.: lbZaZf撇3b命肤6n 3 讨论 H C V系 黄病毒属， 为包膜病毒， 其基因 组约由9
10、 . 6 k b 的 单股正 链R N A组 成， 含有单一的开发读码框架 ( O R F ) o 根据其基因组结 构可 将其分为5 和3 非翻译区( 5 U T R , VU T R ) 及3 个结构蛋白区( C o r e , E l , E 2 ) 和6 个非结构蛋白 区( N S 2 , N S 3 , N S 4 A , N S 4 B , N S 5 A , N S 5 B ) , H C V基因组 具有高度 异质的特征， 其中 5 和3 非翻译区， 特别是5 非翻译区较为 保守， 常被用于诊断目的 “ , E 2 ( H V R I , H V R 2 ) , N S 3 为高变
11、区， 常 被用于基因变异和准种系( q u a s i s e p e c i e s ) 的 研究， 而C o r e , E l 和 N S 5 B区既存在一定的变异， 又具有 H C V基因型和 亚型的特征， 因 此常 被用于 作为 基因分型和分子进化分析。 按照H C V的 基因序列不同， 可将其分为6 种不同的 基因型， 而每种基因型又可 分为若干不同 的亚型。 H C V l h 和H C V l a 呈全球性流行， 在欧洲， H C V l a 多 见于 有静脉吸毒史的年轻人， 而H C V l h 较常见于有输血史的中老年人。 在美国亦发现 亚型l a 和 静脉吸 毒有关。 由
12、 于临床上对丙型肝炎尚无有效的 治疗手段， 因 此做好H C V 易感人群的预防就显得尤为 必要， 包括丙 型肝炎疫苗的研制。 而所有这些医学千 预行为都必须建立在 对丙型 肝炎病毒分子进化了 解的 基础 上1 5 1 。 近 年来随 着生物信息技术的不断发展， 许多可用于阐 述病毒生物进化的数理 模式 和分子生物学软件应运而生， 如利用M e g a 2 构建分子进化树的 方式来对H C V基因序列进行分型， 具有准确、 快速和一次可以 对大量样 本进行分型的特点， 特别是能够对用多聚酶链反 应( P C R ) 法、 限制性片段长度多态性分析( R F L P ) 法和探针 杂交等方法不能
13、区分的H C V基因亚型 作出 正确的 分型。 从笔者的 研究结果来看， 我国的H C V以l b 为主， 占 整个基因型的6 6 . 9 1 0 0 ， 其次 是2 a 和6 a ， 分别占1 3 . 9 7 写和1 0 . 2 9 %。在所有的 样本中， 未发现4 型和5 型， 其原因可能 是这2 种基因 型在我国所占 的比 例较少， 也可能 是由于 样本的偏差所致。另外， 在6 型中， 笔 者发现有1 株( g z 5 2 5 5 7 ) H C V基因 不能归为目 前已 发现的 任何亚型， 可能 为新的基因亚型。 中国 输血杂志2 0 0 6 年第1 9 卷增 刊( 中. 粉血 协会，
14、四 月粉血大会) 37 参 考 文 献 N a k a n o T, l .u L , L i u P , e t a l , V ir a l g e n e s e q u e n c e s r e v e a l t h e v a r ia b l e h i s t o r y o f h e p a t it is C v ir u s i n f e c t i o n a m o n g mu n tr ic s j . J I D , 2 0 0 4 , 1 9 0 : 1 0 9 8 T h e G lo b a l B u r d e n o f h e p a t i
15、t is C Wo r k in g G r o u p . G lo b a l B u r d e n o f D is ea s e ( G B D ) f o r h e p a t it i s C J . J C li n P h s r m a o o l, 2 0 0 4 , 4 4 : 2 0 C h e n Z , We e k K E He p a t it is C v i r u s g e n o t y p in g , i n t e r r o g a t io n o f th e 5 u n t r a n s l a t e d r e g io n c
16、 a n n o t a c c u r a t e ly d i s t in g u is h g e n o ty p e s l a a n d 1 b 0 . J C l in Mi c r o b io 1 , 2 0 0 2 , 4 0 ; 3 1 2 7 S i m m o n d s P . V ir a l h e t e r o g e n e it y o f t h e h e p a t it is C v i r u s J . J He p a t o l , 1 9 9 9 , 3 1 ( S u p p l 1 ) ; 5 4 P y b u s O G , C h a r l es t o n MA,Gu p t e S , e t a l. T h e e p id e m i c b e h a v io r o f t h e h e p a t it is C v i r u s 仁 月, S c ie n c e , 2 0 0 1 , 2 9 2 ( 5 5 2 5 ) : Z 3 3 3