中国汉族RHD阴性个体RH盒子基因的测序及RHD基因的纯合性测定.pdf

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1、 论著 中国汉族 RhD 阴性个体 Rh 盒子基因的 测序及 RHD 基因的纯合性测定 徐群张燕李钦伟张建业 【摘要】 目的分析中国汉族人 RhD 阴性个体 Rh 盒子基因的序列以阐明中国汉族人群 RhD 阴性表 型形成的分子机理， 并对 Rh 盒子基因的扩增产物进行分析以确定 RHD 基因的纯合性。方法74 例 RhD 阴性个体的 DNA 样品首先进行多重聚合酶链反应-序列特异性引物 （PCR-sequence specific primer， PCR-SSP） 分析。然后对 Rh 盒子基因进行特异性测序分析， 同时对 Rh 盒子基因的扩增产物采用聚合酶链反应-限制 性片段长度多态性 （re

2、strict fragment length polymorphism， RFLP） 方法进行 RHD 基因的纯合性测定。结果46 例 （62%） 样品在多重 PCR-SSP 分析中显示缺失 RHD 基因， 在 PCR-RFLP 分析中显示为纯合的 RHD 基因阴 性。22 例 （30%） 样品显示存在 RHD 基因， 其中 19 例显示为杂合的 RHD 基因， 3 例显示为纯合的 RHD 基 因。5 例 （7%） 样品缺失 RHD 基因， 但 PCR-RFLP 分析显示存在 1 个 RHD 基因， 进一步的分析表明它们至 少存在 RHD 基因第 1 和 10 外显子。1 例 （1%） 样品显

3、示存在 RHD 基因， 但缺失第 6 外显子。对 27 例在多 重 PCR 分析中显示缺失 RHD 基因的 RhD 阴性样品的杂化 Rh 盒子基因进行 DNA 测序分析， 表明中国人存 在与白人相一致的杂化 Rh 盒子基因序列。结论RHD 基因缺失是引起中国汉族人 RhD 阴性表型形成的 主要分子机理。中国人 RHD 基因缺失发生于与白人相一致的断点区域。 【关键词】 Rh 盒子基因； RhD 阴性； 红细胞； 免疫血液学； 免疫遗传学 Sequencing the Rhesus boxes and determining the homozygosity of RHD gene in Han

4、 Chinese with RhD nega- tive*XU Qun1， 2，ZHANG Yan3，LI Qin-wei2，ZHANG Jian-ye1. 1 （Institute of Biochemistry and Molecular Biolo- gy，Medical School of Shandong University，Jinan，Shandong，250012 P . R . China） ； 2 （Shandong Blood Center， Jinan，Shandong，250014 P . R . China） ； 3 （Department of Internal

5、Medicine of Renal Disease，the Second Hospital， Shandong University，Jinan，Shandong，250013 P . R . China） Corresponding author：ZHANG Jian-ye，Email：zhjysdu . edu . cn 【Abstract】 ObjectiveTo analyze the sequences of Rhesus boxes of RhD gene，and explore the genetic mecha- nism of RhD negative phenotype i

6、n Chinese Han population. Meanwhile the PCR product of Rhesus boxes is analyzed for determining RHD gene homozygosity. MethodsDNA of 74 RhD negative samples were firstly analyzed with multiplex PCR-sequence specific primer（SSP） . The further analysis was given to Rhesus boxes specific sequencing and

7、 RHD gene homozygosity determined by PCR-restriction fragment length polymorphism （RFLP）analysis to Rhesus boxes. ResultsIn DNA samples of 74 RhD negative individuals，46 samples（62%）showed the absence and homozygous negative of RHD gene；22 samples （30%）all showed the existence of RHD specific exons，

8、of which 19 were RHD gene heterozygous and 3 were homozygous；regardless of PCR-RFLP analysis showing no RHD specific exons，but further analysis of RHD spe- cific PCR revealed one RHD gene，at least RHD gene exon 1 and 10 existing in 5 DNA samples（7%） ；1 sample （1%）was lacking RHD exon 6 although the

9、multiplex PCR showed the RHD gene to be positive. Analyzing the hybrid Rhesus box of 27 RhD negative samples revealed the Han Chinese population to have the same DNA sequence of hybrid Rhesus box as Caucasians. ConclusionThe RHD gene deletion is the main molecular mechanism of causing RhD nega- tive

10、 formed in Han Chinese population，who have had the RHD gene deletion taken place within the defined breakpoint region as Caucasians. 【Key words】 Rhesus boxes gene； RhD negativity； red cells； immunohematology； immunogenetics *Supported by the Scholarship of Governmental Exchange Program for the year

11、2002-2003 of Chinese Ministry of Education and Huygens Programme of NUFFIC（Netherlands Organization for International Cooperation in Higher Education，Proj.No.21937003） Rh 血型系统是人类最具多态性和临床意义的血 型系统之一。RhD 蛋白抗原的高免疫原性常常会引起 胎儿和新生儿溶血病 （hemolytic disease of the fetus and 基金项目： 国家教育部 2002-2003 年度中外政府互换奖学金和荷兰

12、NUFFIC 组 织 （荷 兰 高 等 教 育 国 际 交 流 组 织）Huygens 奖 学 金 资 助 （21937003） 作者单位： 250012 济南， 山东大学医学院生物化学与分子生物学研 究所 （徐群、 张建业） ， 第二医院肾内科 （张燕） ； 山东省血液中心 （徐群、 李钦伟） 通信作者： 张建业， Email：zhjy newborn，HDFN） 、 输血反应和自身免疫性溶血性贫血 等疾病。抗 D 抗体很容易在 RhD 阴性的受血者体内 产生。Rh 抗原由两个高度同源的基因 RHD 和 RHCE 编码， 这两个基因各含有 10 个外显子。 RHD 基因两 侧各有一个 Rh

13、 盒子基因。研究证明在不同种族的 RhD 阴性个体中存在不同的 RhD 阴性遗传形式。在 白人中最常见的 RhD 阴性几乎都是由发生于上、 下游 Rh 盒子基因之间的 RHD 基因缺失引起 1。但亚洲人 中， 在 RhD 阴性的个体中发现了各种类型的 RHD 基 161中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 因 2-7。迄今为止中国人 Rh 盒子基因的序列依然未 知。我 们 采 用 多 重 PCR-序 列 特 异 性 引 物 （PCR-se- quence specific primer，

14、 PCR-SSP） 、 PCR-限制性片段长度 多态 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 和 DNA 测序的方法分析了 74 份中国汉族 RhD 阴性个体 的 DNA 样本， 以探明汉族 RhD 阴性表型的分子机制。 同时对 Rh 盒子基因的扩增产物采用 PCR-RFLP 方法 分析 RHD 基因的纯合性。 1对象与方法 1.1血液样品和 DNA 分离74 份 RhD 阴性和 11 份 RhD 阳性无亲缘关系血液样本的 DNA 取自山东省血 液中心的健康献血者。所有献血者均为居住于山东地 区的汉族人。采用 QIAamp DNA 提取试

15、剂提取 DNA （美国 Qiagen 公司， Valencia，CA） 。 1.2RhD 抗原的血清学鉴定采用单克隆抗-D 试剂 （美国 Gamma 公司，Houston，TX） 对 RhD 抗原进行血 清学鉴定， 检测方法按说明书进行。对于所有 RhD 阴 性样品， 用间接抗人球蛋白试验 （indirect antiglobulin test，IAT） 重新检测 D 抗原以排除弱 D 或部分 D 表型。 未进行吸收放散试验。 1.3RHD 基因的多重 PCR-SSP 分析用文献 8 的 方法， 在一个反应混合物中用 6 对引物特异性扩增 RHD 基因的第 3 7 和 9 外显子。PCR 产物

16、用 12%的 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。 1.4RHD 基因外显子特异性 PCR-SSP 分析根据 RHD 基因的内含子序列设计 RHD 基因的特异性引物 （表 1） 进行 PCR-SSP 分析。第 6 和 10 外显子采用高保 真 PCR 扩增体系 （德国 Roche 分子生物化学品公司） 。 1.5Rh 盒子基因的测序分析根据文献 1 ， 采用高 保真 （expand high fidelity） PCR 扩增体系， 以位于 Rh 盒 子基因同一区 5端的共有引物 rez7 和 Rh 盒子基因同 一区 3端下游 Rh 盒子序列特异的引物 rnb31 扩增 RhD 阴性 DNA 样品， 其

17、扩增产物再以引物 CRBF06/ CRBF08 和 Rhbox5070/ Rhbox5571 （表 1） 进行 Rh 盒子基 因序列的测定。核苷酸序列分析使用美国 ABI 公司 377 型 DNA 测序仪。 1.6PCR-RFLP 方法测定 RHD 基因的纯合性以引 物 rez7 和 rnb31 采用高保真系统扩增 RhD 阴性 DNA 样品， 其 PCR 产物用 Pst限制性内切酶在 37消化 3 h， 消化后的产物再用 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分 析。 2结果 2.1RHD 基因的多重 PCR-SSP 分析和 RHD 基因纯 合性的 PCR-RFLP 测定74 份 RhD 阴性样品中，

18、46 例 （62%） 在多重 PCR 分析中显示缺失 RHD 基因全部的 特异性外显子， 在 PCR-RFLP 分析中显示为纯合 的 RHD 基因阴性。22 例 （30%） 在多重 PCR 分析中显示 存 在 RHD基因的全部特异性外显子， 其中19例PCR- 表 1 检测 RHD 基因的引物 Table 1Primers for RHD gene Primer （引物） Nucleotide sequence （核苷酸序列） Specificity （特异性） Position （位置） Exon* （外显子*） Refrence （参考文献） re01atagagaggccagcacaaR

19、HD- 149/ - 1311 （F）9 RHIN1RtctgtgcccctggagaaccacRHD / CE84/641 （R）10 RHIN2FattgagtgagaggcatcRHD / CE- 57/ - 403 （F） RHDIN3RtttcaaaaccctggaaacRHD80/633 （R） RHIN3FtccagtgagccgagatcgRHD / CE- 199/ - 1824 （F） rb12tcctgaacctgctctgtgaagtgcRHD197/1744 （R）9 rb11tacctttgaattaagcacttcacagRHD- 267/ - 2435 （F）9

20、 RHIN5RgtggggaggggcataaatRHD / CE73/555 （R）10 rf51caaaaacccattcttcccgRHD / CE- 332/ - 3146 （F）9 re71acccagcaagctgaagttgtagccRHD1008/9856 （R）9 re621catccccctttggtggccRHD- 102/ - 857 （F）9 re75aaggtaggggctggacagRHD169/1527 （R）9 RHin7DFctggaggctctgagaggttgagRHD- 328/3078 （F）11 RHin8Rtatgtgatcctcagggaagg

21、agRHD / CE97/768 （R）11 RHDIN8FgttttgacacacaatatttcRHD- 82/ - 679 （F） RHDIN9RcagcaagtcaacatatatactRHD82/629 （R） re91caagagatcaagccaaaatcagtRHD / CE- 40/ - 1810 （F）9 rr4agcttactggatgaccaccaRHDUTR 1541/155210 （R）9 rh7acgtacaaatgcaggcaacRHD / CEUTR 1330/131310 （S）9 rez7cctgtccccatgattcagttaccRhesus boxC

22、onsensus（F）1 rnb31cctttttttgtttgtttttggcggtgcRhesus boxDownstream（R）1 Rhbox5070ctacaggcccatgagagtccaaaRhesus boxConsensus（F）9 Rhbox5571agtgcaagccccaagccttgacaRhesus boxConsensus（R）9 CRBF06gttaatatgggtggctggcRhesus boxConsensus（F） CRBR08cattaagagatacgcacaggRhesus boxConsensus（R） *F： forward （正义引物） ；

23、R： reverse （反义引物） ； S： sequence primer （序列引物） 261中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 RFLP 分析为杂合的 RHD 基因， 3 例为纯合的 RHD 基 因。5 例 （7%） 在多重 PCR 分析中显示缺失 RHD 基因 的特 异性外 显 子， 但 PCR-RFLP 分析显示存在一 个 RHD 基因， 以 RHD 基因外显子特异性引物 （表 1） 进一 步分析表明它们至少存在 RHD 基因第 1 和 10 外显 子。1 例 （1%） 在多

24、重 PCR 分析中显示存在 RHD 基 因， 但缺失第 6 外显子， PCR-RFLP 分析显示存在一个 RHD 基因 （图 1、 2） 。 图 1 RHD 基因的多重 PCR 分析1： DNA 标记物； 2： 存在 RHD 7、 9 外 显子， 缺失 3 6 外显子； 3、 4、 6、 7、 9、 13： 缺失 RHD 基因 6 个外显子； 5、 10 12： 存在 RHD 基因 6 个外显子； 8： 存在 RHD 3 5、 7 和 9 外显子， 但 缺失第 6 外显子 Fig.1RHD multiplex PCR. Lane 1：DNA marker；lane 2：positive on

25、RHD 7，9 but negative on 3-6 exons；lanes 3， 4， 6， 7， 9， 13：negative；lanes 5， 10-12： positive on RHD exons 3-7 and 9；lane 8：positive on RHD exons 3-5， 7 and 9， but negative on RHD exon 6 图 2 RHD 基因纯合性的 PCR-RFLP 分析1： DNA 标记物； 2、 5：RHD 基因阴性纯合； 3、 4、 6、 9、 11-15： RHD 基因杂合； 7、 8、 16-19： RHD 基因阳 性纯合； 10： 阴

26、性对照 Fig.2PCR-RFLP analysis of RHD gene zygosity.Lane 1：DNA marker； lanes 2， 5：RHD - / RHD - homozyous with 4 bands；lanes 3， 4， 6， 9 and 11-15： RHD + / RHD - heterozygous with 5 bands；lanes 7， 8， 16-19：RHD + / RHD + homyozyous with 3 bands；lane 10：water control 2.2Rh 盒子基因的测序RHD 基因的两侧分别是上 游 Rh 盒子基因 （5

27、端） 和下游 Rh 盒子基因 （3端） 。这 两个 Rh 盒子基因方向相同， 长度均约为 9000 bp 并有 98.6%的同源性。 RHD 基因发生缺失的断点部位位 于一个 1463 bp 区域， 上、 下游 Rh 盒子的这个区域的 序列是相同的， 称同一区。在白人中， RHD 基因通过 染色体不等交换的分子机理而缺失， 从而形成杂化 Rh 盒子， 它含有与上游 Rh 盒子同一区 5端之前部分的 相同序列和下游 Rh 盒子同一区 3端之后部分的相同 序列 （图 3） 1。我们对在 RHD 多重 PCR 分析中显示 为阴性结果的样品， 以共有正义引物 rez7 和下游序列 特异的反义引物 rn

28、b31 进行扩增而获得的产物再进行 测序分析， 以研究中国人 RHD 基因的断点区域。用位 于 Rh 盒子同一区 3端之后序列的共同引物 CRBF06/ CRBF0， 对 27 例 RhD 血清学和 RHD 基因均为阴性的 样品进行 PCR 扩增， 然后进行测序分析， 结果均显示 为杂化盒子同一区之后 3部分下游特异性序列。对其 中 13 例样品又用位于同一区 / 断点区 5端前端的共有 引物 Rhbox5070/ Rhbox5571， 进一步分析其序列， 均显 示为杂化盒子同一区 / 断点区 5端前面区域的上游特 异性序列。对于在 RHD 多重 PCR 分析中显示为阳性 结果的样品， 用引物

29、 Rhbox5070/ Rhbox5571， 对其中 11 例和另外 4 例 RhD 阳性对照样品进行了测序分析。9 例 RhD 血清学阴性 RHD 基因阳性且 PCR-RFLP 测定 为 RHD 基因杂合的 DNA 样品同时显示出上游 Rh 盒 子和下游 Rh 盒子同一区 5端前面区域的核苷酸序 列， 即在上、 下游盒子序列有区别的 5 个核苷酸位点上 表现为杂合状态， 另 2 例 RhD 血清学阴性 RHD 基因阳 性且 PCR-RFLP 测定为 RHD 基因纯合的 DNA 样品仅 显示下游 Rh 盒子基因序列。4 例 RhD 阳性对照样品 仅显示下游 Rh 盒子基因序列。以上结果表明中国

30、人 RHD 基因缺失同样发生于已在白人中界定的断点区 域， 或者说至少不会在 Rh 盒子同一区 5端前端区域 之外发生。 图 3 引起白人中普遍存在的 RHD-单倍型的分子机制模型 1 A： RHD 和 RHCE 基因座位的自然结构； B： 上、 下游 Rhesus 盒子基因之间的 高度同源性引发了一个不等交换 . Rhesus 盒子的断点区中有 903 bp 长 度的片段具有 100%同源性； C： 染色体互换的结果形成了 RHD-单倍型 所具有的基因结构 Fig.3Model of the proposed mechanism causing the prevalent RHD-haplo

31、- types in whites 1. A： the physical structure of the RHD and RHCE gene lo- cus； B： an unequal crossing-over between the upstream and downstream Rhesus boxes can be triggered by their high homology. The breakpoint region in the Rhe- sus boxes was found to be of 100% homology for 903 bp； C： resolving

32、 the crossed- over chromosome yields the RH gene structure of the extant RHD-haplotype 3讨论 Rh 血型系统是人类已知的最具多态性和免疫遗 传特性的血型系统。最初研究结果表明， 在白人中几 乎所有 RhD 阴性个体完全缺失 RHD 基因。后来的研 究证实有时 RHD 基因亦存在于 RhD 阴性个体中， 但 发生了某种形式的可导致终止序列的突变， 从而阻止 蛋白表达。在非洲黑人中， 普遍发现有一个 RHD 假基 因 （RHD） ， 该基因含有一个 37 bp 的对第 3 内含子最 后 19 个核苷酸和第 4

33、外显子前 18 个核苷酸的复制， 同时在第 6 外显子上有一个无义突变， 该突变造成在 361中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 红细胞膜上没有 RhD 蛋白出现 10， 12。Okuda 等13在 日本 RhD 阴性个体中发现存在不同的 RHD 基因。近 年研究证实了各种类型的部分或完整 RHD 基因存在 于中国或日本 RhD 阴性献血者中 3， 4， 6， 7， 14-17。在亚洲 人 RhD 阴性个体中还存在一种非常弱的 RhD 抗原表 达型， 即 Del 表现型 2。这种表型在

34、日本或中国 RhD 阴性个体中所占比例为 10% 33% 2， 3， 其弱 D 抗原 在血清学中只能通过烦琐的吸收放散实验加以鉴定。 分子生物学研究证实 Del 型个体的 RHD 基因几乎是 完整的并存在不同的分子机制 4， 6， 7， 16。血清学 RhD 阴性个体中 RHD 基因的存在会造成基因定型的假阳 性结果， 从而阻止了可靠的 RHD 基因定型。这种情况 常出现于非洲和亚洲人中 10，12。 2000 年， Wagner 等 1研究认为 RHD 基因两侧各 有一段约 9000 bp 的侧翼序列片段， 分别称为上、 下游 Rh 盒子 （Rhesus boxes） 。这两段盒子序列有 9

35、8% 的同 源性， 正是 由于这种高度同 源 的 基 因 序 列， 引 发 了 RHD 基因缺失发生于上、 下游盒子之间并形成一个融 合 Rh 盒子。其研究小组以充分的分子生物学研究数 据， 第 1 次构思和阐明了人类 RhD 阴性表型形成即 RHD 基因缺失的分子机制并由此使个体 RHD 基因的 纯合状态的分析预测成为可能。但也有研究证实在非 洲 Rh 盒子基因中存在基因突变， 从而形成变异的 Rh 盒子基因 18。迄今为止对亚洲人 Rh 盒子基因的序列 分析尚未见报道。 本研究结果表明由 RHD 基因缺失而导致的 RhD 阴性是中国人中最常见的一种形式。46 例 （62%） 在 多重 PC

36、R 中为阴性结果 （表明缺失 RHD 基因的 3 7 和 9 外显子） 的样本显示 RhD 阴性是由 RHD 基因缺失 引起。对这组样本 Rh 盒子基因的部分序列进一步测 序表明中国人 RHD 基因缺失发生在已在白人中报道 过的限定断点区域内 1。因此， 在中国人群中用 PCR- RFLP 方法进行 RHD 基因纯合性测定成为可能。 22 例 （30%） 样品在多重 PCR 分 析 中 显 示 存 在 RHD 基因的 6 个特异性外显子， 其中 19 例在 PCR- RFLP 分析中显示为杂合的 RHD 基因， 3 例显示为纯 合的 RHD 基因。由于未进行血清学吸收放散实验， 因 此本组样本

37、为 Del 型的可能性存在。 5 例 （7%） RhD 阴性样本在 RHD 多重 PCR 中显示 为阴性结果。进一步的分析发现它们至少存在 RHD 第 1 和 10 外显子并且与 Dce 单倍型相关。这个结果 与以前研究中 RHD （1） -RHCE （2-9） -RHD （10） 杂化基 因总是与 Dce 单倍型相关的报道相一致 6，7，14。然而 RHCE 基因第 2 外显子的存在以及由此导致的准确的 RHD 和 RHCE 基因之间的拼接位点仍然无法确定。1 例样品在多重 PCR 分析中显示存在 RHD 基因， 但缺 失第 6 外显子， PCR-RFLP 分析显示存在一个 RHD 基 因，

38、 应进一步分析其缺失第 6 外显子的原因。 总之， RHD 基因缺失是引起中国汉族人 RhD 阴性 表型的主要机制。对 Rh 盒子基因的分析表明， 在中 国汉族人 RhD 阴性个体的 RH 遗传座位上， RHD 基因 的缺失是通过同样一种在白人中已描述过的不等交换 机制和同样一个位置 （断点区域内） 发生的。因此， 可 以采用 PCR-RFLP 方法对中国汉族人 RHD 基因的纯 合状态进行测定， 这种测定对 RhD 血清学阴性 RHD 基因阴性、 RhD 血清学阴性 RHD 基因阳性和 RhD 血 清学、 RHD 基因均阳性的样本都是适合的。本研究的 实验结果也证实了这一点。 志谢作者对荷兰

39、 Sanquin 血液基金会 CLB 研究部的 C. Ellen van der Schoot，Martine G.H.M. Grootkerk-Tax 和 Petra A. Maaskant-van Wijk 深 表感谢。感谢其帮助我们建立了 Rh 盒子基因的测序方法和 RHD 基因 纯合性的测定方法并对我们的研究给予出色而详尽的指导 参考文献 1Wagner FF，Flegel WA. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood， 2000，95:3662-3668. 2Okubo Y，Yamaguchi H，Tomita T，e

40、t al . A D variant，Del？Transfu- sion，1984，24:542. 3Sun CF，Chou CS，Lai NC，et al . RHD gene polymorphisms among RhD negative Chinese in Taiwan. Vox Sang，1998，75:52-57. 4Chang JG，Wang JC，Yang TY，et al . Human RhDel is caused by a dele- tion of 1， 013 bp between introns 8 and 9 including exon 9 of RHD g

41、ene. Blood，1998，92:2602-2604. 5Wagner FF，Frohmajer A，Flegel WA. RHD positive haplotypes in D neg- ative Europeans. BMC Genetics，2001，2:10. 6Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al . Molecular background of Rh D posi- tive， D-negative，Del and weak D phenotypes in Chinese.Vox Sang， 2002， 83:156-161. 7Peng CT，Shih

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