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1、世界中西医结合杂志2 0 0 8 年第3 卷第9 期 W o r l dJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a la n dW e s t e r nM e d i c i n e 2 0 0 8 ，V 0 1 3 ，N o 9 - 5 5 5 中药对体外培养软骨生长作用的研究进展 谢文冯坤 【关键词】中药；软骨生长；体外培养；综述 【中图分类号】R 6 8 【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 3 - 6 6 1 3 ( 2 0 0 8 ) 0 9 - 0 5 5 5 0 3 软骨包括透明软骨、弹性软骨、纤维软骨三种。在
2、 骨科临床及实验研究中经常作为研究对象的关节软骨 属于透明软骨，其具有耐摩擦、传导关节负荷、吸收震 动和润滑关节的作用。也是三类软骨中最易发生退变 的关节。随着社会的发展，年龄、肥胖、机械创伤等原因 造成的关节软骨退变、缺损或变性坏死在l 临床上很常 见软骨缺损后自身修复能力很差。长期以来，人们试 图采用各种方法使受损的关节软骨得以恢复，但效果 一直不太理想。为此，关节软骨发病机理及缺损修复一 直是骨科临床和实验研究关注的重点之一。近年来，由 于科学技术及中医药的发展，也使研究者逐渐秀视中 药在软骨生长中的作用，许多学者进行了此方面有益 的探索。现就中药在体外培养软骨生长作用的实验研 究进展作
3、一介绍。 1中药对体外培养软骨细胞增殖的作用 多数研究者采用四甲基偶氮唑盐( M r l T I ) 比色法检 测软骨细胞活性与增殖能力，此方法具有简单快捷、灵 敏度高、准确性与重复性好的优点。亦有研究者采用同 位素标记和流式细胞技术探讨中药对软骨细胞增殖影 响的机理。 单味药对软骨细胞增殖作用的研究一般使用单体 成分、有效部位或提取物等。实验表明 ，8 的川芎嗪 可显著提高体外培养关节软骨细胞的增殖。鹿茸粗多 肽能促进软骨细胞增殖，而纳米鹿茸粗多肽促进软骨 细胞增殖作用更强【引。粉防己碱，在低浓度时，可以促进 体外培养软骨细胞的增殖。提高软骨细胞的活性，维持 软骨细胞的功能表达；而当浓度高于
4、5m 玑时，软骨细 胞的功能表达即受到抑制，但却仍能促进细胞增殖和 提高细胞活性；当浓度高于1 0m 班时，细胞增殖和活 性也受到抑制。按照M T T 试验作为细胞毒件评价的标 准高质量浓度的粉防己碱对软骨细胞具有细胞毒性。 研究结果提示，临床医师在处方使用粉防己碱时，应该 作者单位 河南省洛阳正骨医院，河南洛阳4 7 1 0 0 2 注意剂量避免不良反应 3 1 。l 1 0 的参麦注射液均不 影响软骨细胞的活性对软骨细胞的增殖具有促进作 用，可不同程度地缩短细胞倍增时间，在一定范围内( 1 。5 ) 其作用与剂量呈量效依赖关系：但当药物浓度大于 1 0 后并没有显现出预想中明显促进软骨细胞
5、增殖的 作用，甚至呈现出下降趋势【制。在软骨细胞体外培养的 培养液中直接加人同位素，H 一胸腺嘧啶核苷( m T d R ) ， 示踪发现l 当归、黄芪、川芎嗪能促进D N A 合成，l 丹参和1 0 丹参、黄苠、川芎嗪则能起抑制作用 5 1 。 中药复方的研究为了体现药物在体内代谢后的作 用多采用血清药理学的方法。研究发现，由白芍、牡蛎 等养血中药组成的柔肝方和以熟地、仙灵脾组成的补 肾方的5 及1 0 含药血清对体外培养的软骨细胞有 促进增殖的作用并认为软骨细胞体外培养的血清作 用浓度以低浓度为好这样更接近体内环境【w 1 。同样采 用血清药理学的方法观察以熟地、当归、牛膝、骨碎补、 杜仲
6、为主的补肝肾方血清和由补骨脂、熟地黄、山茱萸 等组成的补肾活血方进行体外软骨细胞增殖影响观 察得到了相似的研究结果【 。由生地黄、泽泻、丹皮、 伏苓、山萸肉、淮山药组成的六味地黄汤中药血清能够 刺激软骨细胞由G o G 期进入s 期和G 2 ，M 期，并呈现 时间的依赖性，其G o G ，期细胞比例降低，S 期与G e M 期细胞之和增加，有效促进了体外培养软骨细胞增殖， 抑制软骨细胞凋亡 】。 2 中药对体外培养软骨器官的作用 中药对体外培养软骨器官作用的研究在国内相对 较少，多数研究集中在中药对软骨细胞的作用，但软骨 器官培养时软骨细胞可维持一个近似体内的微环境， 从而避免细胞培养时的缺陷
7、，使得体外研究各因素对 软骨的作用机制成为可能，也为研究基质大分子与细 胞之间关系提供了较为便利的条件。 笔者所在研究组对此进行了一些初步研究，采用 体外转管培养技术发现3 心叶淫羊藿和箭叶淫羊藿提 取物可明显促进9 日龄鸡胚股骨( 软骨) 长度和重量的 万方数据 5 5 6 世界中西医结合杂志2 0 0 8 年第3 卷第9 期 W o d dJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a la n dW e s t e r nM e d i c i n e 2 0 0 8 V 0 1 3 。N o 9 增加。M T T 法观察软骨
8、细胞增殖加速。而朝鲜淫羊藿、巫 山淫羊藿和川西淫羊藿则没有表现出这种生物活性】。 3 中药对软骨基质的作用 软骨基质主要包括胶原和蛋白多糖等。是保持软 骨正常弹性的重要成分。可采用同位素示踪、胶原的 m R N A 表达等方法观察中药对软骨基质的作用。 采用含硫一3 5 硫酸根离子( ，5 S 0 4 2 ) 、3 H 一脯氨酸( ，H P r o ) 示踪的方法，利用含药血清观察中药对体外培养软 骨基质作用的影响。发现南 ，l 芍、牡蛎等养血中药组成 的柔肝方和以熟地、仙灵脾组成的补肾方均可使3 S O ? - 、 3 H P r o 的掺人增加表明其可增强软骨细胞合成及分 泌蛋白多糖、胶原
9、等基质成分的能力 1 2 。通过在培养液 中直接加入当归、丹参、黄芪、川芎嗪4 种中药注射液， 并用同位素搜3 0 4 2 - 、3 H P r o 示踪，研究亦显示1 或1 0 当归、黄芪、川芎嗪可促进胶原合成，1 丹参有抑制作 用；l 当归、丹参和1 0 当归、川芎嗪能促进蛋白多糖 的合成 s | 。使用考马斯亮蓝测定蛋白质方法观察，4 一 1 6 的川芎嗪对体外培养的软骨细胞蛋白质合成有促 进作用。在体外培养软骨细胞的培养基中加入粉防己 碱，对软骨细胞的糖胺聚糖( 1 ，9 一二甲基亚甲基蓝法测 定) 和型胶原( 酶联免疫测定) 的分泌量都有显著影 响。培养基中的粉防己碱在低质量浓度时，
10、可以维持软 骨细胞的功能表达( 糖胺聚糖和型胶原分泌) 。而当 培养基中粉防己碱的质量浓度高于5m g L 时软骨细 胞的功能表达即受到抑制 3 。分离培养软骨细胞后，以 细胞爬片法，用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术， 配合敏感性加强型原位杂交检测方法。对不同代的软 骨细胞进行型胶原m R N A 原位杂交检测原代及第2 、 4 代软骨细胞型胶原m R N A 表达的差异。以浓度为 0 0 1p , m o l L ，0 1p m o l L ，lp , m o l L ，1 0p , m o i L ，1 0 0p m o l L 的人参皂苷R b l 作用于贴壁3d 后的第2 代病理软骨
11、 细胞，结果：原代、第2 代、第4 代软骨细胞型胶原 m R N A 表达的强度依次下降，适宜浓度( 1p m o l L ) 的 R b l 可增强第2 代软骨细胞型胶原的表达，维持软骨 细胞的正常表型 1 3 。 4 中药对相关细胞因子及化学物质调控软骨生长作 用的影响 很多研究发现白细胞介素一l ( I L 一1 ) 是经典的炎症 调节剂。是调节炎症的始动因素，是分解性细胞因子。 可以促进软骨细胞分泌一氧化氮( N O ) 、前列腺素E ： ( P E G ：) 、金属蛋白酶( M M P s ) 和降低超氧化物歧化酶 ( S O D ) 的活性，从而导致软骨细胞的损害。因此在研究 中药
12、的调控作用时。常以加入I L - l 建立变性软骨细胞 损伤的模型。 以熟地、狗脊、杜仲、补骨脂等1 6 味中药组成的补 肾方药物血清和以人参、麦冬、五味子组成的生脉方中 药血清，能够纠正I L l 对体外培养软骨细胞增殖的抑 制作用，并认为其作用是通过抑制I L l 刺激软骨细胞 产生N O ，阻止N O 诱导软骨细胞凋亡。从而避免N O 对 软骨细胞的破坏 1 4 - 任】。由补骨脂、熟地黄、山茱萸、当归、 丹参等组成的补肾活血方可显著提高S O D 活性阻止 自由基的生成；抑制一氧化氮合酶( N O S ) 的活性。减少 N O 的生成，阻止N O 、自由基对软骨细胞结构的损伤和 破坏。
13、从细胞分子水平研究中药补肾活血方防治骨性 关节炎的作朋机制I t 6 。以川芎、补骨脂、黄苠等中药制 成的活骨胶囊含药血清亦可显著提高软骨细胞S O D 活 性，阻止自由基的生成，并降低P G E ：水平，阻止其对软 骨细胞结构的损伤和破坏 仃 。有研究者发现，用5 防 风注射液治疗膝骨性关节炎有一定效果但体外软骨 细胞培养发现其并不能提高S O D 的活性，但这并不能 说明该药对骨性关节炎无效。认为由于体外软骨细胞 培养可能改变软骨细胞对药物的药理反应。而无论全身 用药还是关节腔注药药物经过体内代谢。则使之失去 对软骨细胞有害的成分，保留有利的成分，有利于软骨 细胞的代谢所以防风的作用机理还
14、有待深入研究f 1 8 】。 M M P s 是细胞外基质降解的主要介质，M M P s 与组织金 属蛋白酶抑制剂( T I M P s ) 的调控构成了软骨与骨生成 破坏的动态平衡。软骨破坏程度与软骨细胞分泌M M P s 与T I M P s 的功能有很大的关系活骨胶囊含药血清和 由独活、桑寄生、当归、怀牛膝、淫羊藿等中药组成的痛 痹方血清可有效地减少I L l 诱导过度升高的M M P l 及M M P 一1 3 的破坏，并能提高T I M P s 的合成，从而拮抗 M M P s 的破坏。起到软骨及骨的保护作用【1 9 - ：0 3 。 5 小结 关节软骨由于其内部无血液供应。外无骨膜
15、，并且 成熟的软骨细胞基本无增生能力。因此，当年龄增大或 遇机械性损伤时易导致退变的发生。目前体外培养多采 用动物的幼体组织或细胞作为观察细胞增殖的对象与 临床以成年人为观察对象不太一致。但研究发现中药 作为改善软骨细胞生长微环境的作用是肯定的。因此。 认为目前研究应以巾药预防、阻止或延缓关节软骨的退 变为主，远期以中药调控软骨细胞的增殖机制、机理研 究以及中药在软骨组织工程中的作用为研究目标。 参考文献 1 晏雪生，彭亚琴，明安萍川芎嗪注射液对体外培养软骨细胞影 响的实验研究 J 中国中医骨伤科杂志2 0 0 2 1 0 ( 1 ) ：1 5 一1 7 2 侯建平，李丽静，王晓丽，等纳米鹿茸
16、粗多肽对体外培养的软骨 细胞代谢的影响 J 中国中医基础医学杂志，2 0 0 6 ，1 2 ( 7 ) ：5 5 5 - 5 5 6 3 崔元璐，姚康德，戚爱棣，等粉防己碱对体外培养软骨细胞的影 响 J 中草药，2 0 0 6 ，3 7 ( 1 2 ) ：18 4 7 一l8 5 0 4 郭玉海，林定坤，王昭佩等参麦注射( 下转第5 5 9 页) 万方数据 世界巾西医结合杂志2 0 0 8 年第3 卷第9 期W o d dJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a la n dW e s t e r nM e d i c i n
17、 e2 0 0 8 ，V 0 1 3 N o 95 5 9 基础。基因与生殖密切相关人的生殖细胞中包含着数 万种基因基因控制着人的胚胎发育、器官系统组织结 构的变化过程和人的每一个发育阶段。而且这种控制 是非常严密而协调的。可见肾与基因对于遗传和生殖 作用具有同等重要性，两者有许多共同之处和内在联 系。田进文等 m 1 认为，肾藏的“先天之精”是遗传信息的 内容和遗传信息的读取过程而遗传信息的化学存在 方式和遗传信息读取过程的化学存在方式是肾藏的 “后天之精”。“先天之精”与“后天之精”的关系是过程 和实体、信息和物质的关系。发生在线粒体内的肾藏过 程是“肾阳”肾阳过程化生的A T P 分子为
18、机体的生命 活动提供了主要的能量来源，起到了温煦、推动生理活 动的作用。以核基因表达为主的肾藏过程是“肾阴”，肾 阴过程化生的各种结构蛋白和酶为细胞结构与功能 的构建和维持提供了化学物质上的保障。进一步证实 肾气与基因对生殖作用具有相似性两者有共同之处 和内在联系。 综上肾对女性生殖起到主导作用现代研究也表 明。肾虚存在下丘脑一垂体一卵巢轴不同环节、不同程度 的功能紊乱而补肾中药可从各个环节调节下丘脑一垂 体一性腺轴功能状态，使其恢复至正常水平。“肾主生 殖”理论在临床及实验研究方面虽取得一定进展但尚 存在一些问题如“肾主生殖”的作用机理研究目前多 偏重于从临床实验研究角度以肾虚证性腺轴相关指
19、 标来进行研究。或从药物反证作用机理来研究。因而 缺少从纯生理模型角度进行“肾主生殖”的机理研究。 此外从分子水平和基因表达方面进行“肾主生殖”机 理的实验研究，目前尚阙如，或仅处于萌芽状态，有待 于今后进一步加强与深化。 参考文献 1 白云静，赛迎春试论“肾为封藏之本” J 河北中医药学报， 2 0 0 1 ，1 6 ( 3 ) ：l 肛1 1 2 俞瑾，杨淑萍，张月萍，等雄激素致高胰岛素高雄激素无排卵大 鼠模型 J 生殖医学杂志，1 9 9 3 ，2 ( 4 ) ：2 1 5 2 1 9 3 归绥琪补肾中药对雌激素致不孕大鼠垂体、卵巢及肾上腺作用 的实验研究 J 中国中西医结合杂志，1 9
20、 9 7 ，1 7 ( 1 2 ) ：7 3 5 4 孙斐，俞瑾，笪翠娣，等雄激素致不孕大鼠肥胖一无排卵机制 及滋肾阴药作用的探讨 J 中华内分泌代谢杂志，1 9 9 9 ，1 5 ( 5 ) ： 2 5 9 - 2 6 2 5 马立正填精补肾中药对老年大鼠下丘脑一垂体一性腺一胸腺轴的 形态学研究 J 中医杂志。1 9 8 9 。3 0 ( 8 ) ：4 9 3 【6 夏蓉两崔兴英补肾调冲法对幼鼠生殖系统作用的实验研究 J 天津中医，1 9 9 4 ，1 l ( 3 ) ：排3 5 7 廖汀玲，符式硅，徐晋勋，等闭经、稀发月经妇女与“肾虚”与性 腺功能变化的观察 J 中西医结合杂志，1 9 8
21、 6 ，6 ( 1 0 ) ：6 9 0 8 李超荆，俞瑾，郭焕如，等肾主生殖与排卵机理初步探讨 J 中 医杂志，1 9 8 2 ，2 3 ( 6 ) ：6 9 9 张晓文，宋清从基因角度探讨“肾主生长发育”的本质 J 中医 药研究，1 9 9 6 ( 3 ) ：1 2 1 4 1 0 田进文，孙奉雷，石巧荣中心法则与肾藏本质 J 山东中医学 院学报，1 9 9 6 ，2 0 ( 1 ) ：1 7 1 9 研究 作者简介：李妍，女，博I = 研究生。研究方向：中医妇科学的I I 缶床 ( 收稿日期：2 0 0 8 - 0 7 - 0 5 ) ( 上接第5 5 6 页) 液对体外培养软骨细胞增殖
22、的影响 J 广东医学，2 0 0 6 ，2 7 ( 4 ) ： 4 7 6 - 4 7 7 5 吕红斌，岳珍。王嘉芙4 种中药对体外培养兔关节软骨细胞代谢 的影响 J 中国运动医学杂志，1 9 9 5 ，1 4 ( 3 ) ：1 3 5 1 3 7 6 冯伟，石印玉，沈培芝，等M T r 法分析中药含药血清对体外软骨 细胞增殖影响的研究 J 上海中医药大学学报，2 0 0 0 ，1 4 ( 1 ) ： 4 3 4 5 7 冯伟，石印玉，沈培芝，等补肾方和柔肝方含药血清对软骨细胞 增殖动力学研究 J 浙江中医学院学报，2 0 0 1 ，2 5 ( 4 ) ：1 5 1 7 8 樊粤光，谢同平补肝
23、肾方血清对体外培养大鼠软骨细胞的影响 J 中药新药与临床药理，2 0 0 4 ，1 5 ( 4 ) ：2 5 7 2 5 8 9 邵敏，牛维，黄杰文补肾活血中药促进体外培养软骨细胞增殖 和蛋白质合成的作用 J 中国临床康复，2 0 0 6 ，1 0 ( 1 9 ) ：5 0 5 2 1 0 舒谦，卿茂盛，曹亚飞，等六味地黄汤含药血清对软骨细胞增 殖、凋亡影响的体外实验研究 J 中国中医药科技，2 0 0 6 ，1 3 ( 4 ) ：2 1 7 - 2 1 9 1 1 冯坤，谢文陈宝龙等5 种淫羊藿对软骨组织生长和软骨细胞 增殖影响的对比研究 J 中国中药杂志，2 0 0 6 ，3 1 ( 2
24、4 ) ：20 6 5 2 0 6 7 1 2 1 冯伟，石印玉，沈培芝，等中药对软骨细胞代谢的影响 J 中 国中医骨伤科杂志，2 0 0 0 ，8 ( 2 ) ：9 - 1 1 1 3 1 3 1 昭佩，杨仁轩，许树柴，等人参皂甙R b l 对体外软骨细胞 型胶原m R N A 表达的影响 J 】中国骨伤，2 0 0 5 ，1 8 ( 9 ) ：5 4 3 5 4 5 1 4 黄枫，谢国平补肾方含药血清对软骨细胞增殖的影响 J 广 州中医药大学学报2 0 0 5 2 2 ( 2 ) ：1 3 8 1 4 0 1 5 周I E 新，李保林，杨荣建，等生脉片对体外培养软骨细胞一氧 化氮合酶的影响
25、 J 安徽中医学院学报，2 0 0 5 ，2 4 ( 5 ) ：3 7 3 9 1 6 邵敏补肾活血中药对体外培养软骨细胞S O D 、N O S 的影响 J 福建中医药。2 0 0 6 3 7 ( 4 ) ：4 8 4 9 1 7 1 李保林，周j E 新，何伟，等活骨胶囊含药血清对培养软骨细胞 前列腺素E ：和超氧化物歧化酶的影响 J 中国中医骨伤科杂 志，2 0 0 5 ，1 3 ( 3 ) ：2 4 2 6 1 8 冯秋珍，杨运东，胡继鹰，等防风注射液对体外培养软骨细胞超 氧化物歧化酶的影响 J 时珍围医国药，2 0 0 2 ，1 3 ( 4 ) ：2 0 5 2 0 6 1 9 李保林，周I E 新，何伟等活骨胶囊含药血清对软骨细胞金属 蛋白酶分泌的影响 J 中医正骨，2 0 0 5 1 7 ( 4 ) ：6 - - 7 2 0 王新东，张前德，纪伟痛痹方血清对体外培养乳兔关节软骨细 胞增殖和M M P 一3 与T I M P l 的影响 J 上海中医药杂志， 2 0 0 6 。4 0 ( 6 ) ：6 4 - 6 5 作者简介：谢文。男，助理研究员。研究方向：骨伤科的基础研究 ( 收稿日期：2 0 0 8 - - 0 7 1 3 ) 万方数据