丹参对大鼠肝星状细胞转化生长因子β1与Ⅰ型胶原MRNA表达的影响.pdf

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1、第 1 2 卷第 1 3 期 2 (N ) =年71 1 中国现代医学杂志 C h in a 7 o u ma l o f Mo d e Me d i c in e V , L 1 2 2 撒 一- 一 一一一= 二 竺 二 一一-= 二= 泛 一今一， 一一一 。 论著 丹参对大鼠肝星状细胞转化生长因子R I 与 I型胶原 mR N A表达的影响 福建医科大学附属第一医院普外科( 3 5 0 0 0 4 ) 蔡方刚 林永望翁山耕石铮刘景丰 目 的 探讨丹参杭扦纤维化的可能机制。方法: 链蛋白晦、 胶原醉离 体灌注大鼠肝胜, N y c o d e n z 密度祥度 离心分离肝星状细胞( H

2、S C ) 体外培养。不同浓度的丹参处理. 用R r - P C R法半定圣检咧H S C的转化生长因 子P ( I G F 有抑制作用 关被词 分类号 p , ) n i R N A与I 型胶原n i R N A的表达。结果: 开参对H S C , 的T G F 一 两与I 型胶原 。结论: 丹参杭肝纤维化作用可能与T G F - s和I 型胶原. R N A的表达下 调有关 丹参肝星:!k f ia 胞T G F 一 P t 胶原 R3 3 2q .R NA的表达 E F F E C T S OF S AL VI A MI L T I OR RHI Z A ON T HE E XP RE

3、S S I ON S OF T R A N S F O R MI N G G R O WT H F A C T O R 0 1 A N D T Y P E I P R OC OL L A GE N mR NA I N RA T HE P A T I C S T E L L A T E C E L L S C a i F a n g g a n g, L i n Y o n g k u n ， We n g S h a n g e n g, e t a ( . D e p a r t m e n t o f G e n e r a l S u r g e r y , t h e F i r s

4、t A f f i l i a t e d H o s p i t a l , F u j i a n Me d i c a l Un i v e r s i t y , F u z h o u 3 5 0 0 0 4 , A b s t r a c t O b j e c t i v e : T o in v e s t ig a t e t h e p o s s i b le m e c h a n is m o f a n t if ib ro t ic a c t i o n o f S a l v ia m i lt io r r h iz a a t m o l e c u l

5、a r l e v e l . Me t h o d s : R a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l w a s s e p a r a t e d f rom r a t l i v e r b y p r o n a s e E a n d c o l l a g e ms e p e r f u s i o n a n d d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n w i t h N y c o d e n z . V a r i o u s c o n c e n

6、t r a t i o n s o f S a l v i a m i l t i o r r h iz a w e re a d d e d a n d i n - c u b a re d . T h e m R N A e x p r e s s io n s o f t r a n s f o r m in g g r o w t h f a c t o r (3 , ( T G F 一 3 ) a n d t y p ep ro c o l la g e n w e r e a n a ly z e d b y R I 一 P C R . R e s u lt s : S a lv

7、i a m il t io r r h iz a c o u ld i n h i b i t t h e e x p r es s io ns o f l G F 一 R , a n d t y p e I p r o c o lla g e n m R N A C o n c l m i o n : T h e a n t i f i b ro t i c a c t i o n o f S a l v i a m i l t io r r h i z a m a y b e r e l a t e d t o t h e d o w n 一 r e g u l a t i o n o f

8、 T G F 一 P , a n d t y p e I p r o c o l l a g e n r n R N A K e y w o r d s : S a l v ia Mi l t i o r r l u m; H e p a t i c S t e l l a t e C e l l s ; T G F 一 P t ; C o l l a g e n 近年来， 动物实验与临床均表明丹参可用于治 疗肝硬化， 并能取得较好的疗效。我们通过观察丹 参对体外培养的大鼠肝星状细胞( H S C ) 转化生长因 子P t ( t r a n s f o r m i n g g r o w t

9、 h f a c t o r p t , T G F 一 P t ) 与I 型胶原m R N A的表达的影响， 来探讨丹参治疗肝纤 维化的可能机理。 I 材料与方法 t _ I 材料与试剂 雄性 S D大鼠， 购 自上海普 尔 一必凯实验动物 1 现为华中科找大学同济tx学院叶启发教授在读博士生 有限公司。W型胶原酶、 N y c o d e n : 购自S i g m a 公 司。链蛋白酶 E , D M E M 细胞培养粉剂购 自 G I B C O R B I 公司。胎牛血清购自H y c lo n e 公司。鼠 抗人结蛋白( D e s m i n ) 单克隆抗体购自D A K O公司

10、 R N A抽提试剂盒( T R I Z O L ) 购自上海生工生物工 程公司， 逆转录试剂购自美国G I B C L B R L公司， 丹 参注射液购自正大青春宝药业有限公司。引物序列 参 考文献I 一 刘 ， 由上海生工生物工程公司合成提 供。 1 . 2 原代大鼠肝星状细胞的分离培养与鉴定 参考翁山耕等f a l 方法， 分离原代大鼠肝星状细 胞。用常规台盼蓝排斥法鉴定细胞活率。选择激发 1 7 万方数据 中国现代医学杂志第 1 2卷 波长为3 2 8 n r n ， 在荧光显微镜下观察并计数刚分离 出来的细胞中能自发出蓝绿色荧光的细胞数， 结合 结蛋白链 S P免疫组织细胞化学法鉴定

11、分离纯度。 细胞长满单层后， 经胰蛋白酶消化并传一代培养。 13 R 丁一P C R实验方法 初次传代的肝星状细胞， 接种于培养孔板内预 培养7 2 h 后， 按每孔不同浓度的丹参药液分为4 组， 药物终浓度分别为 0 ( 对照组， 加磷酸盐缓冲液 P B S ) , 0 0 0 p g / m l 组， 1 2 0 0 p g / m l 组 2 4 0 0 1, g / m l 组 再培养4 8 h ， 分别进行检测。 1 . 3 . 1 R 丁一P C R用 T r i z o l 试剂盒， 按说明书介 绍的方法， 提取 R N A逆转录合成 c D N A， 取 c l ) N A 模

12、板5 p l , 1 0 x b u f f e r 5 . O p l , 2 5 m m o l / L M g C l_ 4 . O p l , 特异上下游引物各2 0 0 p m o l , T a g D N A聚合酶2 . 0 u , 去离子水补至5 0 一 0 川， 加石蜡油5 0 闪封盖后进行扩 增。P C R循环条件为: 9 4 C 3 m i r : 预变性后， 按9 4 r - 4 5 s -5 5 C 4 5 s -7 2 *C 4 5 s 循环， 反复3 5 次， 最终延仲 7 2 *C 5 m i n , 4 保存。 1 . 3 . 2 P C R产物凝胶电泳及观察

13、取 P C R产物 1 O p l 用2 . 0 % 琼脂糖凝胶( S i g m a 公司) ( 含5 p g / m l 澳化乙咤) , S V / c m进行电泳， 同时以1 0 0 b p L a d d e r ( G I H C O B R L公司) 为 D N A m a r k e r s ， 以出现 2 9 8 , 2 5 4 和2 3 4 b p 分 别表示为T G F 一 p : , . , ( I ) 前 胶原, R 一 a c t i n m R N A阳 性结果， 紫外线灯下观察结果并置 B i 。 一 R a d U V P 1 0 0 0 型凝胶成像分析系统(

14、基因公 司) 上分析， 以曲线下峰面积作为P C R产物含量， 用 丁 G F - (3 , m R N A , a c ( I ) 前胶原m R N A分别与p - a c t i n mR N A积分值之比， 表示该基因 mR N A表达 水平。 1 . 4 统计学处理 用S P S S 1 0 . 0 统计软件包进行资料的t 检验与 方差分析， P 0 . 0 5 有显著意义。 2 结果 21 细胞分离培养的结果 每只大鼠 肝脏的星 状细胞得率约为2 x 1 0 7 个， 台盼蓝染色细胞活率超过 9 5 。细胞鉴定依靠在 相差倒置显微镜下， 可见到刚分离出来的肝星状细 胞胞内富含有脂滴的

15、形态; 荧光显微镜下可见在 3 2 8 n m波长的激发光下发出极易碎灭的蓝绿色荧 光: 免疫组化结蛋白表达阳性等， 分离原代细胞纯度 在9 0 %以上。对照组与丹参组中细胞均生长良 好。 2 . 2 丹参对T G F 一 (3 1 m R N A表达的影响 表1 丹参对r G F 一 (3 , m R N A表达的影响临 = ) 丹参浓度( 1 . 8 / m 1 ) U 6 0 0 1 2 0 0 ?4 0 0 T G F 一 p , m R N A积分光密1I f k / R 一 淞L m 积分光密度值 1 . 2 7 6 士0 . 0 4 5 卜0 9 8士 0 . 0 8 9 0 .

16、 7 2 4土0 . 1 0 0 06 1 0土 ( )1 1 4 注: 十与丹参浓Ix为。 组相比P 0 . 0 5 2 . 3 丹参对 I型胶原 ， u R N A表达影响 表 2 丹参对 1型胶原 .R NA表达的影晌r士 ) 丹参浓度( Y 8 / m l ) . 1 I 型胶原 mR N A积分光密度 泣/ (1 -. 1 - 积分光密度值 1 . 0 5 3 to. 1 0 4 0 . 8 2 3 二0 . 1 0 4 0 . 7 5 5 土0 . 1 7 6 06 7 9 土0 . 1 1 7 注: 十与丹参浓度为0 组相比YC0 . 0 5 3 讨论 肝纤维化是各种慢性肝病的共

17、同病理特点。近 年来， 许多研究表明肝星状细胞( H S C ) 是其病理形 成的细胞学基础， 星状细胞活化后的增殖以及合成 大量的以I 型胶原蛋白为主的细胞外基质， 是肝纤 维化发生的主要原因 e 1 。体外培养的H S C ( 直接接 种于塑料平板上) ， 经过6 -1 0 d的培养， 可自发地转 变成肌纤维母细胞， 具有体内活化的生物学特性， 是 较 理 想的 抗肝纤维化的 模型 t 6 l a T G F - 日 ， 以自 分 泌、 旁分泌的方式， 参以肝星状细胞的活化， 并且还 有很强的促纤维生成作用， 可以显著促进 I型胶原 合成! 7 1 。因此， 抑制肝星状细胞的活化及其T G

18、 F - a ， 分泌就有重要的抗肝纤维化作用。 既往研究表明， 丹参在动物实验中， 表现出有抗 肝纤维化的作用， 考虑其机制主要在于丹参具有保 护肝细胞的作用， 可能通过保护肝细胞免受炎症介 质的侵犯， 而阻止肝损伤、 肝纤维化发生( R 1 。本研 究发现， 丹参可抑制T G F 一 (3 , m R N A , 以及I 型胶 原m R N A的表达， 表明丹参对 H S C有直接的抑制 作用， 而非简单经过肝细胞间接起作用。抑制H S C 活化的机制可能在于抑制细胞内的 G F 一 R ， 基因 表达， 阻止细胞活化的持续放大， 并可能通过T G F 一 R : 生成的减少， 影响F G

19、 F - p ; 细胞内信号传导， 下转第2 1页) 万方数据 第 1 3期 何建行， 等: 射频多极针消融仪治疗肺痛的近期临沫研究 瘤MP H) ， 如 I T T , T U A等技术。在我国已治疗 了近万名的B P H患者。 1 9 9 0 年M C G A I I A先引人经皮R P 消融肝癌概 念， 之后 R F消融术实验性地应用于治疗原发性和 继发性肝癌。利用多极针消融电极( 多弹头) 治疗恶 性肿瘤( 肝癌) 是 1 9 9 4 年意大利最早开始。R F研究 最多是在欧洲， 大概有 3 0 0 例病人， 而在美国仅为 8 0 例。临床 七 最大一组病例研究结果十分另人兴 奋， 表

20、现为1 , 2 , 3 , 和5 年生存率分别为9 4 %, 8 6 %, 6 8 %. 4 0 % I l o 1 9 9 9 年北美放射学会有 1 0 多篇采用R F消融 治疗肝癌和治疗各种癌的报道， 最长的经验已有 3 年， 这些医疗专家普遍认为， 这是目前治疗实体肿瘤 ( 特别是肝癌和肺癌) 较满意的技术之一f 2 7 消融术对癌细胞作用病理变化和消融范围的评 估， 目前还没见有报告， 消融术对肺癌治疗也没见报 道， 最近美国学者报导C T导引下行肺癌消融术( 未 正式报告) ， 部分病例消融术后 1 个月再行手术， 发 现癌病灶全部消失。从本组病例， 消融术后行病理 检查发现， 消融

21、对肿瘤细胞有明显破坏作用， 出现大 范围坏死区， 空泡收缩等病理变化， 消融时间越长， 范围就越广， 肿瘤细胞病理破坏越彻底( 指以同一消 融点消融时间分别为5 , 1 0 , 1 2 m i n 。进行比较) 1 3 1 本组有3 2 例病灶均在胸腔镜直视下或开放手术下， 对癌病灶进针， 准确和直接， 所取得的病理结果较为 可靠， 从结果可发现， 癌症细胞大部分被破坏， 但仍 有少量残留癌细胞。究其原因主要是对癌病灶消融 还不彻底， 如果能消融范围更广一些， 在腹腔镜 B 超探头导引下进行消融， 对癌细胞破坏得可能会更 彻底。临床疗效一定会更好。用 C T导引或监控下 进行肺癌消融， 相信是

22、一种很有前途的方法。 本组病例， 术后无 、 例出现明显合并症, 4 例癌 灶广泛者( 晚期患者) ， 消融术后有明显疼痛减低。 至今无 1 例术中死亡。 带有射频多极针的W E 7 5 6 8 肿瘤消融仪， 对肺 癌治疗具有较好的近期疗效。能够使肿瘤病灶大部 分坏死， 明显地减缓肿瘤的发展， 减少疼痛， 有效地 改善患者的生活质量， 在专科医师的使用下是一种 安全有效的治疗设备， 但目前仍未证实其具有根治 作用 。 奋考文献 c n ld w a . . e * H , R a co o n J . E n g e l b e c g S . T . z n s n rc t h r a l

23、 n e e d l e u b l a t in n ( I UR A ) o f t h e p r o s t a t e u s i n g l o w一l e v e l a d i o f , e q u c n e y e n e r g y : a n a n i m a l -p-dm-al s t u d y . E u r u ml , 1 9 9 3 ; 2 4 : 4 0 U C u d c y队R z d i, f , e q u e n c y a b la v o n o f u n re s e c t a b le p d n l a p a n d m e

24、 t a s t a ti c h e p a t i c m a l ig n a n c ie s : r e s . I t , i n 1 2 3 p a t i e n t s . A n n S u , , 1 9 9 9 ; 2 3 0 : 1 -8 苏晓丽. 吴那生 海该环 肺瘫与非恶性疾病患老的肿组织。 - In s , 。 一 j -荃因表达研究 中国现代医学杂志 2 0 0 0 : I N对: 4 9 5 0 1 2 0 0 2 一0 3 一1 8 4 M k43 O VA 7 C i i 辑 ) ( 上接第 1 8页) 从而下调细胞内 I 型前胶原的基因转录， 进而抑制

25、 I 型胶原的产生， 起到抑制肝纤维化的作用。丹参注 射液内主要成分为丹参素、 丹参酚、 丹参酮等， 其水 溶性成分如丹参素、 丹参酚具有对 H S C的抑制作 用Ln , l o ! 。 因此考虑丹参注射液的作用与其含有丹 参酚、 丹参酸有关。丹参对 H S C胶原合成抑制有多 种途径的影响， 其逆转肝纤维化的具体作用机理还 有待于进一步研究。 参考文献 I Y u j i I , G a llu c c i R M . A n f b o d i to tu m o r n e c r o s is fa c t o r a lf a a i t e n u - 8 a t e h e p

26、 e t i c n e c r o s i s a n d i n f l a m m a t io n c a u s e d b y c h ro n i c e x p o s u r e m 。 1 、 。 。 n t h e r a t . F l e p a t o lo g y , 1 9 9 7 ; 2 6 ( 6 ) : 1 5 3 0 一 1 5 3 7 9 _ N ic o c ad八. H e o d e s D . L e f t v e n v i c u l a r f i b - is i n r e n o v a s c u l a r h y - p e

27、 n e n a i v e r , , , . H y l 犯 r 飞 哪 on ， 1 9 9 5 ; 2 6 ( 1 ) 1 1 0 1 一t i t 1 0 3 爱民， 王宝思 慢性肝病间质胶原隋毯因表达的研究 临味肝胆 病杂志, 2 0 0 0 ; 1 6 ( 2 ) : 1 翁山耕 改良法大鼠肝星状细跑的分离墙养及鉴定 北京大学学 报( 医学版)2 0 0 1 ; 3 3 ( 1 ) : 8 3 一8 6 H c r b s t H. T i- i n h i b i t o r o f m e t a l lo p r o t e in a s e 一1 a n d一2 R N

28、A e x - p r e s s ,. . 】 。 r a t a n h u m a n l i v e r fib-is. A m J P a t h o l , 1 9 9 7 ; 1 5 0 ( 5 ) 1 6 4 7 一1 6 5 9 B a e h e m MG, Me y e r D. A c t n ca t io n o f r a t l i a r p e r is i n u s o i d a l l i p o c y t e s b y t r a n s f o r m i n g g ro w t h f a c t o r s d e d , , d f

29、ro m m y o f b r l - b l a m li k e c e l l . A p o t e n t i a l m e c h a n i s m o f ,l f - p e r p a t u a d o n in tie r f i b r o g e n e s i s . J C h o i n v e s t , 1 9 9 2 ; 8 9 : 9 一2 2 C z a j a MJ . Wi e n e r F R. r , v i t r o a n d i n v i , o a s s o r ia d o n o f transform- n g g

30、r o w t h f a c t o r 一 (d , wit h h e p a t ic f i b r o s is . J c e l l 助 1 . 1 9 8 9 ; 1 0 8 : 2 4 7 7一2 4 8 2 邓和军， 马学惠， 许瑞龄， 等. 丹参对肝细胞缺血的保护作用观察 中国中西医结合杂志, 1 9 9 5 ; 1 5 ( 1 5 ) : 1 7 2 徐列明_ 丹参酚性酸 B对大鼠传代肝贮脂细胞增殖形态和台成 细胞外基质的影响 中华肝脏病杂志, 1 9 9 6 ; 4 ( 2 ) : 8 6 - 8 9 苗雄鹰、 庄赞根 响的窦验研究 齐海智. 丹参对肝脏缺血再灌注后病押变化影 中国现代医学杂志, 2 0 0 0 ; 1 0 ( 3 ) ( 2 0 0 2一 0 3 一1 5 4 : 稿r & 成裕W4 9-1 0 店小玲编辑) 2 1 万方数据