七叶皂苷钠对实验性大鼠脑出血后MMP29表达的影响.pdf

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1、J A p o p l e x y a n d N e r v o u s D i s e a s e s , A p r i l 2 0 0 6 , V o l 2 3 , N o . 2 文章编号: 1 0 0 3 - 2 7 5 4 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 5 8 - 0 3 七叶皂昔钠对实验性大鼠脑出血后 MMP - 2 / 9 表达的影响 许宏伟， 杨期东， 肖波， 杨晓苏， 刘晓英， 何双英， 赵真 摘要: 目的探讨七叶皂昔钠对实验性脑出血大鼠脑组织中基质金属蛋白酶一 2 / 9 ( MMP - 2 / 9 ) 表达的影 响。 方法采用胶原酶复制大鼠脑出血模型,

2、 6 0 只S D大鼠随机分为模型组、 治疗组A及治疗组B ， 通过免疫组化和 原位杂交技术动态测定血肿周围脑组织中MMP - 2 / 9 的m R N A和蛋白表达， 同时采用七叶皂昔钠进行治疗。 结果 模型组各时点出现大量MMP - 2 / 9 的蛋白和m R N A阳性细胞， 且MMP - 9 的蛋白和m R N A表达在2 4 -4 8 h 达高峰。 MMP - 9 蛋白与其m R N A表达呈正相关， MMP - 2 蛋白与其m R N A表达呈正相关。 七叶皂昔钠可明显抑制二者的表 达( P 0 . 0 1 ) ， 存在一定的量效关系， 呈负相关。结论七叶皂昔钠可抑制大鼠脑出血早期

3、诱导的血肿周围脑组织 中的MMP - 2 / 9 表达上调。 关键词: 七叶皂昔钠; 中图分类号: R 7 4 3 . 3 4 脑出血; 基质金属蛋白酶- 2 / 9 文献标识码 : A T h e e f f e c t o f s o d i u m a e s c i n a t e o n t h e e x p r e s s i o n o f MMP - 2 / 9 f o l l o w i n g i n t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e i n r a t s X U Ho n g - w e i , Y A N G Q i

4、 - d o n g , X I A O B o , e t a l . ( D e p a r t m e n t o f Ne u r o l o g y , X i a n g y a Ho s p i t a l , C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i - t y , C h a n g s h a 4 1 0 0 0 8 , C h i n a ) A b s t r a c t : O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f s o d i u m a

5、 e s c i n a t e o n t h e e x p r e s s i o n o f MMP - 2 / 9 a f t e r i n - t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e ( I C H) . Me t h o d s T h e I C H a n i m a l m o d e l s w e r e e s t a b l i s h e d b y s t e r e o t a x i c a l i n j e c t i n g 0 . 4 1 U V 1 c o l l a g e n a s e i n t

6、 o t h e r i g h t g l o b e s p a l l i d u s ( G P ) . 6 0 h e a l t h S D r a t s w e r e d i v i d e d r a n d o m l y i n t o i n t r a c e r e b r a l h e m - o r r h a g e m o d e l g r o u p , s o d i u m a e s c i n a t e t r e a t m e n t g r o u p A a n d g r o u p B . T h e e x p r e s s

7、 i o n o f MMP - 2 / 9 g e n e m R N A i n t h e I C H r a t b r a i n s w a s i n v e s t i g a t e d b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d t h e e x p r e s s i o n o f MMP - 2 / 9 p r o t e i n i n t h e I C H r a t b r a i n s h a s b e e n d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h

8、 e m i s t r y . R e s u l t s L o t s o f d e e p b u f f y p o s i t i v e c e l l s o f MMP - 2 / 9 w e r e o b s e r v e d a t e a c h t i m e p o i n t o f o p e r a t io n g r o u p . I n t r e a t m e n t g r o u p A a n d B , t h e p o s it i v e c e l l s o f M M P - 2 / 9 w e r e f e w e r

9、 . A n d t h e r e w a s n e g a t i v e d o s e - e f f e c t r e l a t i o n s h i p f r o m 5 t o 1 0 m g / k g / d ( P 0 . 0 1 ) . C o n c l u s i o n S o d i u m a e s c i - n a t e c o u l d r e f r a i n t h e e x p e r s s i o n MMP - 2 / 9 w i t h d o s e - e f f e c t r e l a t i o n s h i

10、 p a f t e r I C H . K e y w o r d s : S o d i u m a e s c i n a t e ; I n t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e ; Ma t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 / 9 基质金属蛋白酶( MMP s ) 是分解细胞外基质 ( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , E C M)的蛋白酶类中最重要 的一类， 其中MMP - 2 / 9 是MMP s 家族的成员。 由于 MMP - 2

11、/ 9的作用使E C M 降解的正常平衡被破坏， 从而导致多种病理过程的发生， 如髓鞘脱失、 血脑屏 障损伤等。近年来的研究发现MMP - 2 / 9 与脑血管 病的关系密切; 参与了脑缺血和出血后的脑水肿形 成等病理过程n . 2 1 。 七叶皂昔钠是一种较新的抗渗出 药， 具有明显的抗脑水肿作用 3 1 。 为了进一步探讨其 抗脑水肿的分子作用机制， 本研究动态观察七叶皂 昔钠对MMP - 2 / 9 在实验性脑出血大鼠血肿周围脑 组织中表达变化的影响。 1 材料与方法 1 . 1 动物、 主要试剂与药品体重2 0 0 -2 5 馆 健康成年S D大鼠6 0 只， 雌雄各半， 由中南大学湘

12、雅 医学院实验动物中心提供， 大鼠术前自由饮水、 进 食。七叶皂昔钠粉针剂由山东绿叶制药股份有限公 式提供， v u 胶原酶由 美国S i g m a 公司提供， 原位杂交 及免疫组化检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限 公司提供。 1 . 2 动物造模本文参照吴文斌 4 1 等报导的 方法。大鼠经水合氯醛( 4 0 0 m g / k g ) 腹腔麻醉后， 头 部固定于鼠脑立体定位仪上， 暴露颅骨， 根据大鼠脑 立体定位图谱进行苍白球定位: 前自后 l . 4 m m， 矢 状缝右侧旁开3 . 2 m m处开骨窗， 用微量进样器向苍 白球( 进针深度为5 . 6 m m) 注人2 川含0 .

13、4 1 U V II 胶原 酶的生理盐水溶液( 以0 . 5 川/ mi n的速度注人) ， 留 收稿日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 1 1 ; 修订日期: 2 0 0 6 - 0 2 - z 7 作者单位: ( 中南大学湘雅医院神经内科， 湖南 长沙 4 1 0 0 0 8 ) 中 风 与神经 疾病杂志 2 0 0 6 年4 月 第2 3 卷 签 兰 塑 针5 m i n ， 缓慢拔针， 制成脑出血模型。 1 . 3 动物分组与给药6 0只S D大鼠随机分 为脑出血模型组( MG) 、 治疗组A ( T G A) 及治疗组B ( T G B ) 。 每组再随机分为术后6 h , 2

14、4 h , 4 8 h , 9 6 h 4 个 时间点， 各个时间点5 只大鼠。 MG: 造模， 普通饲养， 生理盐水l ml / d腹腔注射; T G A: 造模， 普通饲养， 七叶皂昔钠5 m g / k g / d ， 溶解于l m l 生理盐水中腹腔 注射， 第1 天于胶原酶注射后4 h即开始治疗; T G B 造模， 普通饲养， 七叶皂昔钠1 0 m g / k g / d 。 各组于术 后6 h , 2 4 h , 4 8 h , 9 6 h 分批处死动物， 收集包含血肿的 脑组织标本进行各指标的检测。 1 . 4 实验方法标本选取: 麻醉后， 经主动脉 4 %多聚甲醛灌注后， 剪

15、开颅骨， 取出脑组织作适当 的修整后放人4 %多聚甲醛中固定2 4 h后， 脱水、 透 明、 浸蜡、 包埋、 切片， 片厚4 ft m。免疫组织化学染色 ( S A B C法) 检测MMP - 2 , MMP - 9的蛋白表达及原 位杂交法检测MMP - 2 , MMP - 9的mR N A表达( 按 试剂盒说明书进行) 。 1 . 5 结果观察和统计方法采用高清晰彩色 病理图像分析系统对切片进行图像分析， 取各大鼠 断面水平相似的连续组织切片， 所有切片分析在同 一强度、 同一放大倍数下进行。 每个指标采用阳性细 胞记数法， 每只大鼠每个指标选一张脑切片， 每张切 片在4 0 0 倍光镜下随

16、机选取血肿周围的3 个互不重 叠视野， 每个时间点共计 1 5 个视野， 计数其中每个 视野的该指标阳性细胞数， 取均数作为各时间点该 指标阳性细胞数。各组实验值以均数士标准差( X 士 : ) 表示， 所有数据使用US A S P S S 1 0 . 0统计软件包 进行A N O V A检验、 4 检验、 t 检验和双尾P e a r s o n s 相关检验。 2 结果 2 . 1 大鼠脑出血后血肿周围脑组织中MMP - 9 的蛋白和m R N A表达的动态变化及七叶皂昔钠的 影响术后6 h MG出现了MMP - 9 的蛋白和m R N A 阳性染色细胞， 2 4 -4 8 h达高峰， 阳

17、性细胞来源于微 血管内皮细胞、 胶质细胞和中性粒细胞等， 其蛋白与 m R N A表达呈正相关( r =0 . 3 2 2 ) 。两个治疗组从 2 4 h起蛋 白阳性细胞数均明显少于模型组( P 0 . 0 1 ) ; 且T G A和T G B间存在量效关系， 呈负相关 ( Y 二 8 . 5 3 一 0 . 2 8 8 X , Y代表细胞 数， X代表治 疗量， R Z =O . 0 8 3 ) 。两个治疗组各时点只可见少数的m R - N A阳性表达细胞， 明显少于模型组( P O . 0 1 ) ; 且 治疗组间也存在量效负相关( Y=4 . 4 6 7 一。 . 3 3 X , Y 代

18、表细胞数， X代表治疗量， R 2 =0 . 1 0 9 见表1 ) 0 2 . 2 大鼠脑出血后血肿周围脑组织中MMP - 2 的蛋白和m R N A表达的动态变化及七叶皂昔钠的 影响MG各时点出现大量的深棕黄色MMP - 2的 蛋白和mR N A阳性细胞， 着色部位主要为微血管内 皮细胞、 胶质细胞、 中性粒细胞和神经元等的细胞 浆， 术后 6 -2 4 h达高峰， 以后逐渐下降， 其mR N A 与蛋白表达呈正相关( r =0 . 7 3 1 )。 治疗组各时点的 蛋白阳性细胞数明显少于模型组( P O . 0 1 ) , T G B 在2 4 -9 6 h减少得比T G A更明显( P

19、 O . 0 1 ) ; 且存 在量效负相关( Y=2 4 . 9 -0 . 2 8 7 X, Y代表细胞数， X代表治疗量， R Z =0 . 0 8 2 ) 。 治疗组在各时点其m R - N A阳性细胞数均明显少于模型组( P O . 0 1 ) ; 且治 疗组间也存在量效负相关( Y=3 1 . 6 8 -0 . 7 2 8 X, Y 代表细胞数， X代表治疗量， R Z =0 . 5 3 ， 见表1 ) 0 表1 大鼠脑出血后各时点血肿周围脑组织中MMP - 2 / 9 的蛋白和mR N A表达的动态变化 及七叶皂昔钠的影响( 数据为阳性细胞数， X 士、 , n =1 5 ) 时间

20、( h )组别 MMP - 9 蛋白 3 8 . 6 0 士1 . 6 4 1 6 . 6 0 士1 . 8 4 * 1 6 . 1 3 士1 . 5 1 * 3 7 . 4 7 土 1 . 1 9 3 2 . 5 3 士 1 . 3 6 “ 2 8 . 4 士1 . 5 9 * 3 4 . 6 7 士1 . 0 5 1 7 . 3 3 士1 . 2 9 * 1 1 . 4 0 士1 . 2 4 MMP - 2 蛋白 MMP - 2 mR NA MMP - 9 mRNA 9 . 9 . 2 7 士 1 0 7 士 1 1 8 4 . . 2 7 士 1 . 0 0 士0 . . 5 3 士0

21、. 6 0 士 0 . 8 . 4 7 士 1 . 2 5 * 7 3 士1 . 0 3 * n巧0山 od八 1 2 8 . 4 0 士 1 . 3 0 4 7 士1 . 4 6 0 0 士0 . 7 6 5 3 士 1 4 士 1 . 1 1 . 4 0 士2 . 1 3 . 4 0 士0 . 7 4 “ 7 . 5 3 土0 . 9 9 4 . 2 0 士0 . 7 7 “ 3 . 8 7 士0 . 9 2 7 . 3 3 士 0 . 8 2 MG协哪MG朴TGB 5 . 4 7 士0 . 3 . 0 0 士0 .8 5 4 . 3 . 2 7 士 0 . 2 7 士 0 . 5 9 7

22、 0， 屯 、 3 3 1 3 . . 8 0 士1 . 9 3 士 0 . 5 . 2 7 士0 . 8 8 “ 9 . 9 3 士1 4 . 2 7 士0 . 0 . 9 3 士0 . 8 8 “ 0 3 . 6 7 土0 . 8 2 “ 0 3 5 . 4 0 士1 . 2 4 1 0 . 0 7 士1 . 1 6 “ 2 . 7 3 士0 . 9 6 “ 0 3 4 . 2 0 士0 . 7 7 9 . 2 0 士0 . 8 6 1 . 4 7 士 1 . 1 3 “ 0 3 3 士0 . 7 3 士0 . 3 . 2 0 士0 . 6 8 “ “ MG协MG朴TGB T G A和T

23、G B 分别与同时程M G比 较 P 0 . O 1 ; T G B 与同时程T G A比 较P 0 . 0 1 ; T G B 与同时程T G A比 较# P 0 . 0 5 J A p o p l e x y a n d N e r v o u s D i s e a s e s , A p r i l 2 0 0 6 , V o l 2 3 , N o . 2 3 讨论 近几年的研究表明， MMP - 2 / 9 参与了缺血和出 血性脑损伤， 我们的前期研究发现: 大鼠脑出血后血 肿周围有明显的血脑屏障通透性增加和脑水肿发 生， 均于2 4 - 4 8 h达高峰。 正常和假手术组可见极少

24、 量 MMP - 2的蛋白和 m R N A阳性染色细胞; 而无 MMP - 9 的表达。模型组出现大量MMP - 2 / 9 的蛋白 和m R N A阳性染色细胞; 且与脑水含量和血脑屏障 通透性增加呈正相关。说明大鼠脑血肿周围早期诱 导了MMP - 2 / 9 的表达上调， 其可能参与了出血后血 管源性脑水肿的形成E 2 1 。七叶皂昔钠是三菇皂昔的 钠盐， 是从中国药典收藏的中药婆罗子的干燥成熟 果实中提取的， 研究发现它是一种较新的抗渗出药， 主要作用为消肿、 恢复毛细血管正常通透性、 控制炎 症和改善循环， 具有明显减轻出血后脑水肿的作 用D . 5 。 目 前七叶皂昔钠已大量用于急

25、性脑卒中的临 床治疗， 为了进一步探讨七叶皂昔钠抗脑水肿的分 子作用机制， 本研究动态观察比较了MMP - 2 , MMP - 9 基因m R N A和蛋白在MG, T G A和T G B大鼠脑组 织中的表达变化。发现模型组各时点出现了大量的 MMP - 2 / 9的蛋白和m R N A阳性细胞; 且MMP - 9的 蛋白和m R N A表达在2 4 -4 8 h 达高峰。 MMP - 9 的蛋 白与其m R N A表达呈正相关， MMP - 2的蛋白与其 m R N A表达呈正相关。通过用七叶皂昔钠治疗后， 两治疗组在各时点的MMP - 2 和MMP - 9 基因m R N A 和蛋白表达阳

26、性染色细胞数均明显少于模型组; 并 且T G B的MMP - 2和MMP - 9阳性细胞数减少得比 T G A更明显， 在T G B的4 8 9 6 h只可见到极少量 MMP - 2 和 MMP - 9 的表达。 这提示七叶皂昔钠可能 具有抑制MMP - 2和MMP - 9 基因m R N A和蛋白表 达的作用; 且可能在一定范围内存在着量效关系。 其 作用机制不清楚， 有研究证实E 5 . 6 七叶皂昔钠具有类 激素样作用， 给大鼠腹腔注射七叶皂昔钠可诱发血 浆A C T H和皮质酮浓度增高， 作用为氢化可的松的7 8 倍; 而皮质类固醇具有抑制MMP S 的作用。 这是 由于MMP - 9

27、 基因的启动子区含有一个激活蛋白一 1 区和核因子 B区， 对多种炎性刺激有反应， 糖皮质 激素通过与 f o s / j u n 二聚体形成复合物， 阻止其与激 活蛋白一 1 的结合而抑制MMP - 9 基因转录 7 J 。 由此推 测七叶皂昔钠抗脑水肿的分子作用机制， 可能是通 过直接抑制 MMP - 2和MMP - 9 基因转录或转录以 上水平发挥作用， 又可能与控制炎症、 改善微循环等 有关 s . 5 1 。 总之， 由于七叶皂昔钠的药理作用广泛， 其 抑制MMP - 2 和MMP - 9 表达的确切作用机制可能较 为复杂， 是否还通过其他途径发挥作用， 有待于进一 步的探讨。 参考

28、文献 1 P l a n a s A M, S o l e S , J u s t i c ia C , e t a l . E x p r e s s i o n a n d a c t i v a t i o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 a n d - 9 i n r a t b r a i n a f t e r t r a n s i e n t f o c a l c e r e b r a l i s c h e m i a J . N e u r o b i o l D i s , 2 0 0 1

29、 , 8 ( 5 ) : 8 3 4 - 8 4 6 . 2 许宏伟， 杨期东， 刘晓英， 等. MMP - 2 / 9 与脑出血后脑水肿的关系 探讨 J . 中风与神经疾病杂志， 2 0 0 4 , 2 1 ( 4 ) : 2 9 5 - 2 9 7 . 3 许宏伟。 杨期东， 刘晓英， 等. 脑出血后血脑屏障通透性的变化及 七叶皂昔钠的影响【 J . 脑与神经疾病杂志， 2 0 0 4 , 1 2 ( 4 ) : 2 4 5 - 2 4 7 . 4 吴文斌， 胡长林， 李国秧， 等. 脑内血肿吸收机制中相关因素的分 析 J . 现代康复， 2 0 0 0 , 4 ( 4 ) : 5 8 1

30、 - 5 8 3 . 5 陈旭， 郑惠民， 丁素菊. 七叶皂昔钠抗出血后脑水肿的实验研究 J . 中国临床神经科学， 2 0 0 1 , 9 ( 1 ) : 2 7 - 2 9 . 6 张宁， 肖波， 李静， 等. 实验性 自身免疫性肌炎中MMP - 2 , MMP - 9 , T I MP - 1 的表达及甲基强的松龙的影响 J . 湖南医科大 学学报， 2 0 0 3 , 2 8 ( 1 ) : 5 - 8 . 7 J o n a t C , R a h m s d o r f H J , P a r k K K, e t a l . A n t i t u m o r p r o m o

31、 t i o n a n d a n t i i n f l a m m a t i o n : d o w n - m o d u l a t i o n o f A P - 1 ( F o s / J u n ) a c t i v i t y b y g l u c o c o r t i c o i d h o r m o n e J . C e l l , 1 9 9 0 , 6 2 ( 6 ) : 1 1 8 9 - 1 2 0 4 . 中国现代神经疾病杂志 征订启事 中国现代神经疾病杂志 为国家卫生部主管、 中国医师协会主办的神经病学类期刊。 办刊宗旨是理论与 实践相结合、 普及

32、及提高相结合， 反映我国神经内、 外科临床科研工作重大进展， 促进国内外学术交流。所设 栏 目包括专家论坛、 述评、 论著、 短篇论著、 综述、 神经影像学、 病例报告、 临床病理( 例) 讨论、 新技术与新方 法、 技术改进、 临床药物应用、 会议纪要以及国外医学进展等。 中国现代神经疾病杂志 为国家科技部中国科技论文统计源期刊， 国内外公开发行。 中国标准连续出版 物号: I S S N 1 6 7 2 - 6 7 3 1 ; 1 2 - 1 3 6 3 / R 。 国际大1 6 开型， 彩色 插图6 4 页， 双月刊， 每月1 6日出 版。 每期定价8 元， 全年4 8 元。2 0 0 5 年由邮局发行， h P 发代号为: 6 - 1 8 2 ， 请向各地邮局订阅; 亦可向编辑部直接仃阅。编辑部地 址: 天津市河西区气象台路1 2 2 号天津市环湖医院内 中国现代神经疾病杂志 编辑部， 邮政编码: 3 0 0 0 6 0 。 联 系电话: ( 0 2 2 ) 2 3 5 5 2 3 2 8 ， 传真: ( 0 2 2 ) 2 3 5 5 2 3 2 9 0