【SN商检标准大全】SNT 2125-2008 李痘病毒检疫鉴定方法.pdf

《【SN商检标准大全】SNT 2125-2008 李痘病毒检疫鉴定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【SN商检标准大全】SNT 2125-2008 李痘病毒检疫鉴定方法.pdf（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 李痘病毒检疫鉴定方法 犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 犾 狌 犿狆 狅 狓狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 前 言 本标准的附录为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国广东出入境检验检

2、疫局、 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研 究所、 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人： 陈定虎、 王章根、 李明福、 胡学难、 李桂芬、 王秀芬、 冯黎霞、 管维。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 李痘病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。 本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、 组培苗、

3、种子和果实的检疫鉴定。 原理 李痘病毒学名： （ ） ， 别名： ， 是核果类果树危险性最大的病毒之一， 其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据； 该病毒的分类地位、 地理分布、 寄 主范围和症状、 传播途径、 血清学特性及基因组特征等参见附录。 仪器设备、 用具及试剂 仪器设备 酶标检测仪。 扩增仪。 电泳仪。 台式高速冷冻离心机。 凝胶成像系统。 电子分析天平。 用具 移液器（ ， ， ， ） 。 研钵。 、 、 离心管。 酶联板。 犈 犔 犐 犛 犃检测试剂 包被缓冲液 犿 犔（ 狆 犎 ） 碳酸钠（ ） 碳酸氢钠（ ） 叠氮化钠（ ） 溶于 蒸馏水中， 溶液的 为

4、， 不需要调 值。 犘 犅 犛缓冲液 犿 犔（狆 犎 ） 氯化钠（ ） 磷酸二氢钾（ ） 磷酸氢二钠（ ） 氯化钾（ ） 叠氮化钠（ ） 用无菌水溶解并定容至 。 样品抽提缓冲液 犿 犔 二乙基碳酰二胺（ ） 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 用 缓冲液（ ） 溶解并定容至 。 洗涤缓冲液 犿 犔 吐温 缓冲液 无菌水 叠氮化钠（ ） 抗体稀释缓冲液 缓冲液 牛血清白蛋白（ ） 底物缓冲液（ 狆 犎 ）

5、犿 犔 二乙醇胺 加蒸馏水 叠氮化钠（ ） 用盐酸（ ） 调 至 ， 然后定容至 。 底物溶液 在底物缓冲液中加入碱性磷酸酶的底物对硝基苯磷酸钠（ 狆 ， ） ， 浓度 为 。 犘 犆 犚检测试剂 犚 犖 犃抽提缓冲液 ， ， ， 巯基乙醇 犜 犈 缓冲液 ， ， 犜 犃 犈 缓冲液 ， 加样缓冲液 溴酚蓝 引物合成 根据已报道的 以及其株系和株系的保守序列设计通用和特异性引物： 通用引物： ： ： 特异性引物： 株系： ： ： 株系： ： ： 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w

6、w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 检验方法 症状检查 要仔细检查李属科植物叶片及其花、 果实及种子是否有畸形、 环斑、 斑驳等可疑症状并采集可疑症 状的样品。 血清学检测 对采集的植物样品采用三抗夹心免疫吸附测定法（ ） 进行检测。 ） 采取 表现可疑症状的植物组织， 同时用 健康组织和组织提取缓冲液作为阴性对 照， 加入 样品抽提缓冲液研磨制成待测样品液； ） 用包被缓冲液按要求稀释多克隆兔抗 抗体， 然后在酶联板的加样孔中加入 该稀释 抗体， 保温； ） 然后用洗涤缓冲液洗涤酶联板次， 每孔加入洗涤缓冲液 ， 每次 ； ） 取待测样品液 加入酶联板

7、的加样孔中（ 以健康组织和植物组织抽提缓冲液作为阴性对 照） ， 保温过夜（ 约） ； ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板次， 每孔加入洗涤缓冲液 ， 每次 ； ） 每孔加入 合适稀释的第二抗体（ 单克隆 抗体） ， 孵育； ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板次， 每孔加入洗涤缓冲液 ， 每次 ； ） 每孔加入 合适稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体， 孵育； ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板次， 每孔加入洗涤缓冲液 ， 每次 ； ） 每孔加入新配制的底物溶液 ， 然后在不同的时间分别测定它们的 吸收值。 植物组织总犚 犖 犃提取 选取 表现可疑症状的植物组织， 同时用 健康组织作为对照。将植物组织加液氮冷 冻后充分

8、研磨后装入 离心管中。 在离心管中加入冰冷的 抽提液， 颠倒混合均匀。 台式冷冻离心机 犵离心 。 取上清液， 加入 苯酚 三氯甲烷异戊醇（ ， 体积比） ， 颠倒混合均匀。 台式冷冻离心机 犵离心 。 取上清液， 加入 三氯甲烷 异戊醇（ ， 体积比） ， 颠倒混合均匀。 台式冷冻离心机 犵离心 。 取上清液， 加入 无水乙醇和 醋酸钠 ， 颠倒混合均匀。 台式冷冻离心机 犵离心 。 留沉淀， 用 冷乙醇洗涤一次， 置于超净工作台上吹干， 然后溶于 无 酶 的水中。 犚 犜 犘 犆 犚检测 ： 在 离心管中加入去离子水 ， 加入总 ， （ ） （ ） ， （ ）， 水浴 后立即置于冰上 ；

9、然后 离心 ； 再加入 第一链合成缓冲液， ； 抑制剂（ ） ； 反转录酶（ ） ； 。 扩增： 在 离心管中加入 扩增缓冲液 ， 氯化镁（ ）， （ ）， （ ） ， （ ） 或 （ ） 或（ ） ， 第一链合成反应液， 加水至 ， 然后加入 犜 犪 狇 聚合酶 （ ） 。 循环条件： 变性 ； 然后 ， ， ， 循环 次； 最后 延伸 ；保存反应产物。以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照， 为阳性对照。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z .

10、n e t ) 无需注册 即可下载 琼脂糖电泳 用 缓冲液和琼脂糖按 的浓度配好， 在微波炉中熔化均匀， 冷却至 左右。 加入 ? 核酸染料或溴化乙锭（ ） ， 混合均匀， 倒入凝胶平台上， 插上样 品梳。 待凝胶凝固后， 拔出梳子， 加入适量的 缓冲液（ 缓冲液没过凝胶上表面约） 。 取加样缓冲液与 反应液混合均匀， 然后分别将其和合适的 分子量标准物 加入样品孔中。 接通电源进行电泳， 电压 。 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离 片段时， 停止电泳。 将整个胶置于凝胶成像系统中观察， 并照相记录。 结果判断 血清学结果判断 对照孔的 值（ 缓冲液孔、 阴性对照及阳性对照孔） ， 应该在

11、质量控制范围内， 即： 缓冲液孔 和阴性对照孔的 值小于 ， 当阴性对照孔的 值小于 时， 按 计算； 阳性对照 值阴性对照 值大于。 在满足了 质量要求后， 结果判断如下： 样品 值阴性对照 值大于等于， 判为阳性； 样品 值阴性对照 值小于， 判 为阴性。 若满足不了 质量要求， 则不能进行结果判断。 如果是商品试剂盒， 则根据试剂盒的说明来判断。 犘 犆 犚 结果判断 当琼脂糖电泳时， 如果阳性对照和待测样品都出现 特异性条带而阴性对照没有该 条带， 即可判定该样品带有李痘病毒， 否则不带有李痘病毒。 对于带有李痘病毒的样品， 如果用 和 二引物扩增出 条带， 则说明该 李痘病毒为株系；

12、 当用 和扩增出 条带， 则说明该李痘病毒为株系。 样品保存与复核 样品保存 检测为阳性的植物样品， 经液氮冷冻后， 于 下保存。保存样品做好登记和标记工作。 结果记录与资料保存 包括： 样品的来源、 种类、 采样时间、 检测时间、 地点、 方法、 结果等， 并有实验人员的签字。 要有实验数据结果， 要有电泳检测阳性结果照片。 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责， 主要考察实验原始数据记录及其电泳照片 等资料的完整性和真实性， 必要时进行复核实验。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全

13、面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犃 （ 资料性附录） 李痘病毒介绍 犃 李痘病毒分类地位 马铃薯病毒科（ ） ， 马铃薯病毒属（犘 狅 狋 狔 狏 犻 狉 狌 狊） 。 犃 地理分布 保加利亚、 罗马尼亚、 阿尔巴尼亚、 塞浦路斯、 法国、 德国、 希腊、 匈牙利、 意大利、 卢森堡、 波兰、 葡萄 牙、 西班牙、 叙利亚、 土耳其、 英国、 俄罗斯、 埃及、 智利及美国、 加拿大、 澳大利亚等国家。 犃 寄主范围 能侵染木本科和草本科寄主。李属植物是其自然寄主， 最主要的自然寄主是刺李（犘 狉 狌 狀 狌 狊 狊 狆

14、犻 狀 狅 狊 犪） ， 其他如杏（犘 狉 狌 狀 狌 狊 犪 狉 犿 犲 狀 犻 犪 犮 犪） 、 桃（犘狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪） 和日本的李子（犘犱 狅 犿 犲 狊 狋 犻 犮 犪） 以及甜 樱桃（ 犘犪 狏 犻 狌 犿） 和酸樱桃（犘犮 犲 狉 犪 狊 狌 狊） 。菊叶香藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犳 狅 犲 狋 犻 犱 狌 犿） 和克利夫兰烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 狉 犾 犪 狀 犱 犻 犻） 通常作为草本指示植物。 犃 寄主症状 犃 刺李（犘 狉 狌 狀 狌 狊 狊 狆 犻 狀 狅 狊 犪） 和日本的李子（ 犘犱 狅 犿 犲 狊

15、 狋 犻 犮 犪） ： 叶片上出现严重的扩散淡绿环或斑 驳， 果皮上出现深色的环， 果肉出现红色或淡红色， 果核带棕色斑点， 大约有 果实在未成熟前落果。 犃 桃（犘 狉 狌 狀 狌 狊 狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪） 、 甜樱桃（ 犘犪 狏 犻 狌 犿） 和酸樱桃（犘犮 犲 狉 犪 狊 狌 狊） ： 叶片出现黄化叶脉、 褪绿 斑点和畸形， 果皮出现散布的淡黄色斑点。 犃 杏（犘 狉 狌 狀 狌 狊 犪 狉 犿 犲 狀 犻 犪 犮 犪） ： 叶片出现散布的暗绿色斑和线， 果实变形， 果皮散布着坏死环， 核上有 黄色的环。 犃 菊叶香藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犳 狅 犲 狋 犻

16、 犱 狌 犿） ： 当摩擦接种时， 叶片上表现为枯斑症状。 犃 克利夫兰烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 狉 犾 犪 狀 犱 犻 犻） ： 经过摩擦接种时， 全株表现为系统性侵染症状。 犃 传播途径 自然条件下由蓟短尾蚜（ 犅 狉 犪 犮 犺 狔 犮 犪 狌 犱 狌 狊） ， 桃短尾蚜（犅犺 犲 犾 犻 犮 犺 狉 狔 狊 犻） ， 忽布疣额蚜（犘 犺 狅 狉 狅 犱 狅 狀犺 狌 犿 狌 犾 犻） 和桃蚜（犕 狔 狕 狌 狊 狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪 犲） 作非持久性传播， 并易经汁液接种传播； 长距离扩散则主要靠感染病毒的植 物繁殖材料的调运。 犃 血清学特性

17、是良好的免疫原。根据血清学可将 划分为 （ ） 、 （ ） 、 （ ） 、 四种血清型， 其中株系和株系为最主要流行株系。 犃 基因组特征 基因为单分体基因组， 含有一条正单链 分子， 大小约 核苷酸， 其外面包被 个 均一的蛋白质亚基。 的 端为 ， 端为 （） 。基因组编码一个长的多聚蛋白， 随后自身 催化裂 解产 生 个产 物： 包 括 （端 蛋 白， ） ，（ 蛋 白 酶 辅 助 成 分， ） ， （ ） ， ， （ 细胞质内含体蛋白， ） ， ， （ 与基因组连接的蛋白， ） ， （ 核内含体蛋白， ， 包括 ） ， （ 核内含体蛋白， ， 依赖于 的 聚合酶） 以及 （ 外壳蛋白：

18、 ） 。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 犜 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 李痘病毒检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街 号 邮政编码： 网址 电话： 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷 印数 书号： 定价 元 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 国内外标准大全 如果你需要更多标准可以到 进行免费查 阅。 如果你购买的文档存在缺页、字迹模糊、乱码等情况，请大家 通过论坛消息与我联系。 豆丁网国内外标准下载地址 http:/