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1、书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 建兰花叶病毒检测方法 犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犆 狔 犿 犫 犻 犱 犻 狌 犿犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 前 言 本标准的附录、 附录为规范性附录， 附录 为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会
2、提出并归口。 本标准起草单位： 中国检验检疫科学研究院、 中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人： 相宁、 张永江、 杨翠云、 于翠。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 建兰花叶病毒检测方法 范围 本标准规定了建兰花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。 本标准适用于可能带有建兰花叶病毒的所有进境兰花种苗， 包括商品种苗、 组培苗和脱毒苗等兰花 种质的
3、检疫和鉴定。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 植物病毒免疫电镜检测方法 原理 建兰花叶病毒学名： ， 缩写： 。建兰花叶病毒是侵染兰花的主要病 毒之一， 其血清学特性、 外壳蛋白的特异性是本标准制定的主要依据， 该病毒的分类地位、 地理分布、 寄 主范围和症状、 传播方式、 粒体形态及基因组特征等参见附录。 仪器、 用具及试剂 仪器 透射式电
4、子显微镜。 酶联检测仪。 电子天平。 仪。 凝胶成像系统。 榨汁机。 高速冷冻离心机。 超速离心机。 用具 可调移液器（ ， ， ， ） 和可调移液 器头。 酶联板。 管。 研钵。 犈 犔 犐 犛 犃检测试剂 包被缓冲液（ 狆 犎 ） 碳酸钠 碳酸氢钠 叠氮化钠 溶于 蒸馏水中， 用盐酸调至 ， 再用蒸馏水补足。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 犘 犅 犛磷酸盐缓冲液（ 狆 犎 ） 氯化钠 磷酸二氢钾
5、磷酸氢二钠 氯化钾 叠氮化钠 溶于 蒸馏水中， 用氢氧化钠调至 ， 再用蒸馏水补足。 洗涤缓冲液（犘 犅 犛 犜） 吐温 加至 样品抽提缓冲液 亚硫酸钠 聚乙烯吡咯烷酮（ ） 加至 酶标抗体稀释缓冲液 牛血清白蛋白 底物缓冲液 二乙醇胺 水 叠氮化钠 用盐酸调至 ， 加水至。 病毒检测（ 采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验 犈 犔 犐 犛 犃） 实验步骤 按要求的浓度或 用包被缓冲液稀释包被抗体， 每孔加 。将酶联板加盖或用保 鲜膜包好， 放在 孵育。 清空酶联板中溶液， 用 加满各孔， 后倒掉， 孔向下在滤纸上拍干， 再重复二次。 取 待检测组织研碎， 加入 的抽提缓冲液， 离心 后取上清液得到
6、 待检样品。分别将稀释到适当浓度的阳性对照、 阴性对照和待检样品各 加入已包被的孔中， 为 保证实验的准确性， 建议每个样品再设一个重复。将酶联板加盖或用保鲜膜包好， 下孵育过夜。 同步骤 洗板。 用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释到适当浓度或 ， 每孔加 。将酶联板加 盖或用保鲜膜包好， 在 下孵育。 同步骤 洗板。 按 的浓度将狆 （ 对硝基苯磷酸酯） 溶于底物缓冲液中（ 使用前配制并注意避光以 防变色） ， 制成底物溶液。每孔加 底物溶液。将酶联板加盖或用保鲜膜包好， 室温下避光孵育 。 在酶联仪 波长下测定或读取各孔的吸收值 。 结果判断 如果是试剂盒， 根据试剂盒的说明来判定。 对照
7、孔的 （ 缓冲液孔、 阴性对照孔和阳性对照孔） ， 应在质量控制范围内， 即： 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 缓冲液孔和阴性对照孔的 小于 ， 当阴性对照孔的 小于 时， 按 计算； 阳性对照孔 阴性对照孔 在 ； 孔的重复性基本一致。 在满足了 质量要求后， 结果原则上可判断如下： 样品 阴性对照 大于或等于时， 判定结果为阳性； 样品 阴性对照 大于或等于时， 判为可疑样品， 需重新做一次， 或用
8、其他方法加 以验证； 样品 阴性对照 小于时， 判定结果为阴性。 如满足不了 质量要求， 则不能进行结果判断。 注：不同批次的抗体浓度、 阴性对照和阳性对照浓度是不一样的， 稀释倍数要根据当时批次而定。如果是检测试剂 盒， 则根据试剂盒的要求而定。 综合判定 样品用血清学检测为阳性， 再选择 （ 见附录） 、 生物测定（ 见附录） 和电镜观察（ 见 ） 中任一种方法检测仍为阳性者， 可判断样品携带建兰花叶病毒。 样品的保存与复核 叶片样品妥善保存于冰箱中， 病汁液妥善保存于 冰箱中， 试管苗保存于组培室中， 以备 复核。 完整的实验记录要包括： 样品的来源、 种类、 时间、 实验的时间、 地点
9、、 方法和结果等， 并要有经手人 和实验人员的签字。生物学鉴定需有鉴别寄主的症状照片， 电镜观察需有病毒粒体照片， 血清学检测需 有酶联板反应的照片， 检测需要有电泳图片。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犃 （ 资料性附录） 建兰花叶病毒的背景资料 犃 分类地位 马铃薯 病毒属成员。 犃 寄主范围 自然寄主有兰属（ 犆 狔 犿 犫 犻 犱 犻 狌 犿 ） 、 蝴蝶兰属（犘 犺 犪 犾 犪 犲
10、狀 狅 狆 狊 犻 狊 ） 、 万带兰属（犞 犪 狀 犱 犪 ） 、 卡特 来兰属（ 犆 犪 狋 狋 犾 犲 狔 犪 ） 、 文心兰属（犗 狀 犮 犻 犱 犻 狌 犿 ） 等。人工接种可局部侵染昆诺阿藜、 墙生藜、 望江 南、 曼陀罗、 决明、 洋金花、 番杏等多种植物。 犃 病害症状 兰属植物产生花叶及坏死斑； 卡特来兰属植物产生花叶， 花上产生坏死斑； 蝴蝶兰属植物产生花叶、 水浸状局部斑点； 万带兰属植物产生褪绿斑。 犃 分布地区 广泛发生于世界各地兰花上， 日本、 美国尤为普遍。我国的上海、 广州、 福州、 厦门、 成都等地也有 发生。 犃 传播方式 该病毒汁液传染， 桃蚜能传毒。通过
11、染病种苗、 组培苗的调运等途径进行远距离扩散传播。 犃 粒体形态 病毒粒体呈线状， 长约 ， 宽约 。 犃 基因组 病毒基因组为单链线状 ， 单分体基因组， 长约 。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犅 （ 规范性附录） 犚 犜 犘 犆 犚检测方法 犅 试剂 犅 核酸提取试剂为商品化犜 狉 犻 狕 狅 犾试剂 犅 犜 犃 犈 三（ 羟甲基） 氨基甲烷（ ） 冰乙酸 乙二胺四乙酸（ ） 加蒸馏水至
12、。用时加蒸馏水稀释至 。 犅 加样缓冲液 溴酚蓝 （ 质量浓度） 蔗糖水溶液 犅 实验步骤 犅 核酸提取 犅 取 样品， 液氮研细， 加入 ， 混匀， 倒入 管中。 犅 离心 ， 将上清液移入一新 管中。 犅 加入 三氯甲烷， 猛烈振荡 ， 离心 ， 小心吸取上层无色水 相到新离心管中。 犅 加入等体积异丙醇， 混匀， 静置 ， 离心 ， 保留沉淀。 犅 加入 冷乙醇， 悬浮沉淀， 离心 ， 干燥沉淀。 犅 加入 水， 溶解沉淀（ 必要时可于 加速溶解） ， 存于 备用。 犅 引物设计 根据已报道的 基因保守序列（ 登录号： 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ） 的保守序列设计特异 性引物，
13、 有对引物可供选择： ： ： 预期扩增大小为 。 ： ： 预期扩增大小为 。 犅 反转录 反转录体系 ， 、 、 反向引物、 模板 ， 反应 ， 冰上放置 ， 加入 酶倍缓冲液、 （ 反转 录酶） 、 酶抑制剂， 反应。 犅 犘 犆 犚扩增 反应体系 ， 上述反转录产物、 倍 缓冲液（ 含 ） 、 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 、 下游引物 、 上游引物 、 犜 犪 狇 聚合酶和 水 。 反应程序为：
14、 第一对引物： ； ， ， 个循环； 。 第二对引物： ； ， ， ， 个循环； 。 犅 琼脂糖凝胶检测 犅 制备凝胶 将 和电泳级琼脂糖按 配好， 在水浴中融化混匀， 冷却至 左右。 犅 加溴化乙锭 溴化乙锭浓度为 ， 与制备的凝胶混匀， 倒入凝胶槽中， 插上样品梳， 待琼脂糖凝固， 取 出梳子。 犅 加样 将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔， 并加入分子量标准物。 犅 电泳 接通电源， 根据凝胶的厚度， 缓冲液浓度等设置使用的电压， 电泳 。 犅 结果观察 电泳结束后用凝胶成像系统记录结果。 犅 电泳结果记录 见图 、 图 。 图犅 犚 犜 犘 犆 犚扩增产物（ 引物对） 凝胶电泳图 图
15、犅 犚 犜 犘 犆 犚扩增产物（ 引物对） 凝胶电泳图 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 附 录 犆 （ 规范性附录） 生物测定（ 鉴别寄主及其症状） 犆 试材 犆 鉴别寄主 用病毒汁液摩擦接种指示植物： 昆诺藜（ 犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿狇 狌 犻 狀 狅 犪） 、 苋色藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犿 犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉） 、 望江南（犆
16、犪 狊 狊 犻 犪 狅 犮 犮 犻 犱 犲 狀 狋 犪 犾 犻 狊） 、 决明（犆 犪 狊 狊 犻 犪 狋 狅 狉 犪） 、 蔓陀罗（犇 犪 狋 狌 狉 犪 狊 狋 狉 犪 犿 狅 狀 犻 狌 犿） 、 洋金花（犇 犪 狋 狌 狉 犪 犿 犲 狋 犪 犾） 、 番杏（犜 犲 狋 狉 犪 犵 狅 狀 犻 犪犲 狓 狆 犪 狀 狊 犪） 、 珊西烟（犖 犻 犮 犪 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿 ） 、 千日红（犌 狅 犿 狆 犺 狉 犲 狀 犪 犵 犾 狅 犫 狅 狊 犪） ； 并设置阳性对照和健康对照， 每天观察发病症状。 犆 磷酸盐缓冲液（ ） 、 硅藻土。 犆 方法 犆 病
17、样加（） 的磷酸盐缓冲液， 在研钵中研碎。 犆 叶面预先撒上少量硅藻土， 将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面。 犆 无菌水冲洗叶表。 犆 做好标签， 置于隔离温室中， 温度控制在 左右。 犆 每天观察记载寄主反应。 犆 鉴别寄主的症状表现 见表 。 表犆 鉴别寄主的症状表现 鉴别寄主名称显症时间症 状 番杏 （犜 犲 狋 狉 犪 犵 狅 狀 犻 犪 犲 狓 狆 犪 狀 狊 犪） 褪绿斑。 昆诺藜 （犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿狇 狌 犻 狀 狅 犪） 症状出现晚， 后期出现褪绿黄褐色斑。 蔓陀罗 （犇 犪 狋 狌 狉 犪 狊 狋 狉 犪 犿 狅 狀 犻 狌 犿） 初期出现褪绿斑，
18、后来形成黑褐色枯斑。 洋金花 （犇 犪 狋 狌 狉 犪犿 犲 狋 犪 犾） 黑褐色枯斑， 最后枯斑连成一片， 叶片坏死。 决明 （犆 犪 狊 狊 犻 犪 狋 狅 狉 犪） 初期出现褪绿、 透明的小斑点， 后来变成黑 褐色坏死斑， 直径左右。 望江南 （犆 犪 狊 狊 犻 犪 狅 犮 犮 犻 犱 犲 狀 狋 犪 犾 犻 狊） 初期出现褪绿、 透明的小斑点， 后来变成黑 褐色坏死斑， 直径 左右。 千日红 （犌 狅 犿 狆 犺 狉 犲 狀 犪犵 犾 狅 犫 狅 狊 犪） 无症状。 珊西烟 （犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿 ） 无症状。 苋色藜 （犆 犺 犲 狀 狅
19、狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犿 犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉） 无症状。 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 书书书 犜 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 建兰花叶病毒检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街 号 邮政编码： 网址 电话： 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷 印数 书号： 定价 元 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 国内外标准大全 如果你需要更多标准可以到 进行免费查 阅。 如果你购买的文档存在缺页、字迹模糊、乱码等情况，请大家 通过论坛消息与我联系。 豆丁网国内外标准下载地址 http:/