二硫化二砷诱导哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡的研究.pdf

《二硫化二砷诱导哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡的研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《二硫化二砷诱导哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡的研究.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9N o v ，1 8 ( 3 1 )3 7 9 7 矗? ：i ：罅i 。 j ，察谁硪梵毳 二硫化二砷诱导哮喘豚鼠肺泡灌洗液中 嗜酸细胞凋亡的研究 许继德，白洪波，黄志祥 ( 广州医学院，广东广州5 1 0 1 8 2 ) 摘要】目的 观察二硫化二砷( A M 岛) 诱发哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡的作 用。方法采用卵白蛋白制备哮喘豚

2、鼠模型并激发哮喘，提取肺泡灌洗液并分离其中的嗜酸 细胞。将嗜酸细胞悬浮生长于含l O 小牛血清的R P M I1 6 4 0 培养液中，嗜酸细胞初始浓度 均为2x1 0 9L 。A 组A s ：岛以1 4 0 63m g L 终浓度分别加入细胞培养液中培养3 ，6 ，1 2 ， 2 4 ，4 8h 。B 组将A s 2 岛终浓度调整为0 0 4 ，O 0 9 ，0 ，1 8 ，0 3 5 ，0 7 0 ，1 4 l 。2 8 1m g L ，培养6 h 。2 组均以不加A s z S 2 为对照。W r i g h t S 染色、透射电子显微镜观察嗜酸细胞的形态学变 化。流式细胞仪检测观察嗜酸

3、细胞凋亡率。结果 嗜酸细胞与胸S 2 作用6h 后，W r i g h t s 染色、透射电子显微镜均观察到嗜酸细胞出现凋亡的形态学改变。将嗜酸细胞与终浓度为 1 4 0 63m g LA s 2 1 在培养基中分别培养3 ，6 ，1 2 ，2 4 ，4 8h 后，流式细胞检测可见嗜酸细胞凋亡率随着胸S 2 作用时间 的延长而先升高，于2 4h 达最高，凋亡率为2 7 1 9 ，而后下降。各不同时间组嗜酸细胞凋亡率与对照组比较均有显 著性差异。将嗜酸细胞与不同终浓度A s 2 是在培养基中分别培养6h 后，流式细胞检测可见嗜酸细胞凋亡率随着 A s 2 S 2 浓度的增加而升高，各不同浓度组嗜

4、酸细胞凋亡率与对照组比较亦均有显著I 生差异。结论胸S 2 可促进哮喘 豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡，随着A s 2 S 2 作用时间的延长和浓度增加这种作用更明显。 关键词哮喘；二硫化二砷；嗜酸细胞；凋亡；g g 鼠 中图分类号 R 一3 3 2 文献标识码】A 文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 9 ) 3 1 3 7 9 7 0 3 S t u d yo fA s 2 s 2i n d u c i n ga p o p t o s i so fe o s i n o p h i l sf r o mb r o n c h o a l v e o l a rl a v

5、 a g ef l u i di na s t h m a t i cg u i n e ap i g s X uJ i d e ，B a iH o n g b o ，H u a n gZ h i x i a n g ( G u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ，G u a n g z h o u51018 2 ，G u a n g d o n g ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v eI ti st Oo b s e r v et h ei n d u c i n gf u n c t i

6、 o no fA 眈s 2o nt h ea p o p t o s i so fe o s i n o p h i l sf r o mb r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i di na s t h m a t i cg u i n e ap i g s M e t h o d sT h ea s t h m a t i cg u i n e ap i gm o d e l sw e r ep r e p a r e dw i t ho v a l b u m i na n dt h e e o s i n o p h i l sw

7、e r es e p a r a t e df r o mb r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d E o s i n o p h i l sw e r ec u l t u r e di nR P M I16 4 0c u l t u r e , s o l u t i o nc o n t a i n i n g1 0 c a l fs e r u m T h ei n c i p i e n tc o n c e n t r a t i o no fe o s i n o p h i l sw a s2X1 0 9L1 蛔S 2w

8、 i t ht h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no f 1 4 0 63m g Lw a sa d d e di nt h ec e l lc u l t u r ef l u i df o r3 ，6 ，1 2 ，2 4a n d4 8h o u r si ng r o u pA F i n a lc o n c e n t r a t i o no fA s 2 岛i n g r o u pBw a sa d j u s t e dt O0 0 4 ，0 0 9 ，0 1 8 ，0 3 5 ，0 7 0 ，1 4 1 ，2 8 1m g Lf o

9、r6h o u r s T h o s ew i t h o u tA s 2 s 2w e r ea sc o n t r o lf o rt h et W Og r o u p s T h em o r p h o l o g yo fa p o p t o s i so fe o s i n o p h i l sW a so b s e r v e db yW r i g h t Ss t a i n i n ga n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e T h er a t eo fa p o p t

10、o s i so fe o s i n o p h i l sw a sa s s a y e db yt h ef l o wc y t o m e t r y R e s u l t sE o s i n o p h i l sa p o p t o t i cm o r p h o l o g i c a lc h a n g e sw e r eo b s e r v e db yW r i g h t Ss t a i n i n ga n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e6h o u r sa f

11、t e ri n t e r a c t i o nb e t w e e n e o s i n o p h i l sa n d 牺S 2 A f t e r1 4 0 63m g L 鹏s 2c u l t u r i n gf o r3 ，6 ，1 2 ，2 4a n d4 8h o u r s ，t h ea p o p t o t i cr a t eo fe o s i n o p h i l s i n c r e a s e dw i t ht h ep r o l o n g a t i o no f 如& i n t e r v e n t i o n ，a n dr e

12、 a c h e dt h ep e a kw i t ht h ea p o p t o t i cr a t eo f2 7 19 ，a n dt h e nd e c r e a s e d T h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si na p o p t o t i cr a t eb e t w e e nd i f f e r e n tt i m eg r o u p sa n dc o n t r o lg r o u p A f t e r6h o u r s t r e a t m e n to f

13、A S 2 S 2o fd i f f e r e n tf i n a lc o n c e n t r a t i o n ，t h ea p o p t o t i cr a t eo ft h ee o s i n o p h i l si n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gA s 2 s 2c o n e e n t r a t i o n T h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si na p o p t o t i er a t eb e t w e e nd

14、 i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ng r o u p sa n dc o n t r o lg r o u p C o n c l u s i o nA s 2 是c a np r o m o t et h ea p o p t o s i so fe o s i n o p h i l sf r o mb r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i di na s t h m a t i cg u i n e ap i g T h i se f f e e ti sm o r eo b v i o

15、 u sw i t ht h ep r o l o n g a t i o no fA 岛s ，i n t e r v e n t i o na n dc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e K e yw o r d s ：a s t h m a ；A s 2 S 2 ；e o s i n o p h i l s ；a p o p t o s i s ；g u i n e ap i g 作者简介】 许继德( 1 9 5 6 一) ，男，教授，主要从事呼吸生理学研究。 基金项目 广州市教育局科技项目( 6 1 0 4 1 ) ；广州市科技局课题( 2 0

16、 0 8 J l C 2 6 1 ) 万方数据 3 7 9 8 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9N o v ，1 8 ( 3 1 ) 中药雄黄的主要成分是二硫化二砷( A s 2 S 2 ) ，内服对治疗 支气管哮喘和慢性支气管炎有较好的疗效I 。支气管哮喘是 由多种细胞、细胞因子和炎性递质参与的，以气道高反应性为 特征的非特异性气道慢性炎症性疾病。嗜酸细胞在哮喘发病 过

17、程中起重要作用，可促进嗜酸细胞凋亡，是哮喘气道症状缓 解及减轻的重要机制之一。已有研究证实，雄黄有促进哮喘 豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞凋亡的作用【2 - 3J 。本实验采用雄 黄的主要成分A s 2 S 2 与哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞共培 养的方法，观察A s z S 2 对哮喘豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸细胞的 作用，为阐明牺S 2 治疗哮喘的作用和机制提供实验依据。 1 实验资料 1 1 材料H a r t l e y 品系豚鼠，雄性，体质量3 0 0 4 0 0g ，由 中山大学中山医学院实验动物中心提供，动物合格证号为 2 0 0 4 A 0 9 7 。所有实验豚鼠饲养于清洁环境，室温，自由

18、进食 和饮水。A s 2 是、卵白蛋白、3 K 3 0 离心机购自S i g m a 公司，盐 酸苯海拉明注射液购白天津药业集团新郑股份有限公司， P e r c o l l 细胞分离液购自瑞典A m e r s h a mB i o s c i e n c e 公司，R I M I 1 6 4 0 培养基购自吉诺医药生物有限公司，小牛血清购自杭州 四季青生物工程材料有限公司，P R o N E B 雾化器为P A R I 公 司产品，R ( Y ) 3 0 0 T V B B 恒温培养箱为R E V C O 公司产品。 1 2 哮喘豚鼠模型制备在第1 天和第8 天，将2 卵白蛋 白( 溶于生

19、理盐水) 与4 氢氧化铝凝胶等体积混匀后，每只 豚鼠腹腔内注入0 5m L 。第2 l 天每只豚鼠腹腔内注射盐酸 苯海拉明5m g k g ，3 0 m i n 后将豚鼠置于密闭容器中，2 卵白 蛋白气雾激发，豚鼠哮喘发作3 0r a i n 后停止。4 8h 后进行肺 泡灌洗。 1 3 嗜酸细胞分离豚鼠股动脉放血致死。立即用H a n k s 液从气管注入5m L ，轻轻按摩豚鼠胸部2 0 3 0s 后回收，回 收率大于9 0 ，重复上述过程2 遍。将全部肺泡灌洗液以2 1 6 9r m i n4 离心1 0m i n ，收集沉淀细胞并用H a n k s 液重 悬。配制不同体积质量的P e

20、 r c o l l 液：在l Om L 离心管中依次 加入1 1 0 5k g L 。1 0 9 0k g L ，1 0 8 0k g L 的P e r c o l l 液各2 m L ，后加入细胞悬液2m L ，以33 6 1r m i n2 0 离心1 5r a i n ， 离心完毕后，分别同收不同比重交界面的细胞层。用H i n k e l m a n n s 染色液染色并计数嗜酸细胞。 1 4 嗜酸细胞培养将嗜酸细胞悬浮生长于R P M I1 6 4 0 培 养液，培养液内含1 0 小牛血清，于3 7 。5 c C h 的恒温培 养箱中培养。嗜酸细胞初始浓度均为2 1 0 9L 。

21、1 5 实验方法参照文献 4 方法，配制鹏s 2 浓度为5 6 2 5 m g L ，过滤，4 保存。A 组A s 2 S 2 以1 4 0 63m g L 终浓度分 别加入细胞培养液中，培养3 ，6 ，1 2 ，2 4 ，4 8h 。B 组将趣S 2 终 浓度调整为0 0 4 ，0 0 9 ，0 1 8 ，O 3 5 ，0 7 0 ，1 4 1 ，2 8 1m g L ， 培养6h 。2 组均以不加A s 2 S 2 为对照。 1 6 嗜酸细胞的形态学观察光镜下观察：培养6h 后的嗜 酸细胞用P B S 洗2 遍并将其浓度调整至1x 1 0 9L - 。，甲醛固 定。涂片，W r i g h

22、 t s 染色液染色2r a i n ，光学显微镜下观察。电 子显微镜观察：培养6h 后的嗜酸细胞培养液以10 0 0r m i n 离心1 0r a i n ，再用2m LP B S 液重恳细胞，置于2m L 离心管 中，以25 0 0r m i n 离心2 0r a i n ，使细胞成团。小心吸去上清 液，加入戊二醛。送电镜室观察。 1 7 流式细胞仪检测将培养3 ，6 ，1 2 ，2 4 ，4 8h 的嗜酸细胞 和终浓度为0 0 4 ，0 0 9 ，0 1 8 ，0 3 5 ，0 7 0 ，1 4 1 ，2 8 1m g L A s 2 岛培养的嗜酸细胞分别与等体积的P B S 混合，以

23、10 0 0r r a i n4 离心5m i n ，弃去培养液，P B S 重悬细胞并调整嗜酸细 胞浓度为1x1 0 9L - 。取嗜酸细胞悬液0 7 5m L 与等体积一 3 0 的7 0 乙醇混合，置于1 5m LE P 管中送榆。 1 8 统计学处理采用S P S S1 3 0 软件进行统计学处理，计 量资料用叠5 表示，t 检验分析组间差异，P G M C S F I L 一3 ；对嗜酸细 胞凋亡有促进作用的细胞因子主要有I F N 一7 、I L 一1 0 、I L 一 1 2 、J L 一1 8 和T G F p 等。因此，凋亡相关基因在二硫化二砷 促进嗜酸细胞凋亡中的作用如何以

24、及二硫化二砷促进嗜酸细 胞凋亡与参与细胞凋亡的细胞因子关系如何尚需进一步研究。 参考文献】 1 王浴生，邓文龙，薛春生中药药理与成用 M 2 版北京：人 民卫牛出版社，1 9 8 3 ：1 1 5 7 1 1 6 1 2 】许继德，黄志祥，杨少微，等雄黄诱导哮喘豚鼠肺泡灌洗液中 嗜酸细胞凋亡的研究 J 中国f 临床药理学与治疗学，2 0 0 6 ，1 1 ( 9 ) ：1 0 5 2 1 0 5 5 3 黄志祥，许继德，卢冬艳，等雄黄对哮喘豚鼠嗜酸细胞作用的 量效和时效性 J 中国组织工程研究与临床康复，2 0 0 7 ，1 l ( 2 9 ) ：5 7 6 9 5 7 7 2 4 钟璐，陈芳

25、源，韩洁英，等A T R A 和雄黄对r 1 血病细胞P M L 基 因及蛋白表达的影响 J 上海第二医科大学学报2 0 0 1 ，2 1 ( 2 ) ：1 0 6 1 0 9 5 M o r g a nR K 。C o s t e l l oR W D u r c a nN ，e ta 1 D i v e r s ee f f e c t so f * s i n o p h i lc a t i o n i cg r a n u l ep r o t e i n so nI M R 一3 2n e r v ec e l ls i g n a l i n g a n ds u r v i v

26、 a l J A mJR e s p i r ( = e I IM o lB i n l ，2 0 0 5 ，3 3 ( 2 ) ：1 6 9 一 1 7 7 6 F a nT C ，F a n gS L ，H w a n gC S ，e ta 1 C h a r a c t e r i z a t i o no fm o l e c u l a r i n t e r a c t i o n sb e t w e e ne o s i n o p h i lc a t i o n i cp r o t e i na n dh e p a r i n J J B i o l ( ；h e m

27、，2 0 0 8 ，2 8 3 ( 3 7 ) ：2 5 4 6 8 2 5 4 7 4 7 L uT ，G a l i j a s e v i cS ，A b d u l h a m i dI ，e ta 1 A n a l y s i so ft h em e c h a n i s m b yw h i c hm e l a t o n i ni n h i b i t sh u m a ne o s i n o p h i lp e r o x i d a s e J B rJ P h a r m a c o l ，2 0 0 8 ，1 5 4 ( 6 ) ：1 3 0 8 1 3 1

28、 7 8 邹春芳，张祖贻如S 2 诱导肺腺癌细胞凋亡的实验研究 J 实 用肿瘤杂志，2 0 0 4 ，1 9 ( 6 ) ：5 0 7 5 1 0 9 陈雪瑜，赵淑清，王爱华，等二硫化二砷联合伊马替尼诱导慢 性髓细胞一血病细胞凋亡机制探讨 J 诊断学理论与实践， 2 0 0 8 ，7 ( 1 ) ：6 7 7 2 1 0 K a n k a a n r a n t aH ，M o i l a n e nE ，Z h a n gx P h a r m a c o l o g i c a lr e g u l a t i o n o fh u m a ne o s i n o p h i la p o p t o s i s J C u r rD r u gT a r g e t sl n f l a m mA I 1 e r g y ，2 0 0 5 ，4 ( 4 ) ：4 3 3 4 3 5 1 1 陈金中医药健脾益肺法与哮喘嗜酸细胞凋亡 J 辽宁中医学 院学报2 0 0 3 ，5 ( 2 ) ：9 6 9 7 【收稿日期】2 0 0 9 0 5 1 0 飞l砌 眵 1 7 么 t a 扩 一阅一 么 t 4 矿 一订一 一迎一 一迎一 一定一 一欢一 臼 扩 a 7 么 t 4 扩 z t一稿 曼一 z t一投一 一迎一 Z t a 矿 一定一一弼一 弘噶噶噶咚气 万方数据