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1、浙江预防医学2 0 0 5 年第 1 8卷第5 期Z h e ii a n g P r e v M a d , M a y 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o 二氧化氯消毒液的致突变性研究 宋燕华蔡德雷严峻夏勇郑云燕鹿伟 【 摘A目的 研究二氧化氯消毒掖的致突变性。方法 设0 . 5 , 2 . 0 和5 . 0 g / k g 体重3 个p i I组，观察 其对小鼠骨髓细胞傲核和小鼠 精子畸形的影响。设6 2 5 , 1 2 5 0 . 2 5 0 0 和5 0 0 0 p g / m l 4 个剂量组.进行V 7 9 细胞 鉴 因突变试 验 。结果各 剂量组 在体 内体外致
2、 突变性研究 中未见有 致突 变作 用结论在本 实验 条件 下 。 该 二 氧化抓 消毒液无 致突变 性。 【 关链词 】二氧化 抓致 突变性 A a R 1 A 举 4 : R - 3 3 2文 傲标识 Q : A文童 编号 : 1 0 0 7 -0 9 3 1 ( 2 0 0 6 ) 0 5 - 0 0 1 1 - 0 3 S tu d y o n几 I u ta g e 川d ty o f S O N G Y a n - h o a, C A I D e - l e i , Y A N九 n, e t . l Z h ef ia n g , 3 1 0 0 0 9 , C h in a
3、) Mu 魄e 川d tyofC h l o r in e D i o aJ d e D is in f e c ta n tMu e wG ty ( G e n i e , f o r D i - P r e v ew ia n a n d C o ra r a l o f Z h ej ia n g P r o u ia cc , H a n g z h o a A 6 t r a c t O 句 e c d v e T o e m d y th e m u m g e n ic h y o f c h lo ri n e d io x id e d is in fe c t a n t
4、. M e th o d s l a v w o ro te s t o n e m o an c e ll m m ro n u c l e u s te s t a n d s p e r m s h a p e a b . - o d i ,y te a t w e r e p r o c e s s e d 卜 s e tti n g 3 d iff e re n t d oa e g ro u p . o f 0 . 5 . 2 . 0 a n d 5 .0 以 k g . I n v i tro m a m m a l ia n cell ( V 7 9 c e ll ) g e
5、n e m m a ti o a te s t w s e c ar r ie d o u t 忡ac tu n g 4 d iff e r e n t d o s e g ro u p s o f 6 2 5 , 1 2 5 0 , 2 5 0 0 a n d 5 0 0 0呵m l p e r p la t e . R e s u l ts 1 1 te r e -s n o o h v i. u x m u t e g e n i c to xi c it y in a ll g ro u p s . C o n c lu si o n s C h l o r in e d io x i
6、 d e d is in fe c t a n t h a s n o m u ta g a n ic i ty in th e st u d y c o n d it io n s . 【 K e y w o r d s C h l o ri n e D i o x id e D is i n fe c ta n t ; M u t a g e n ic i ty 现在饮用水的消毒已由原来单一的抓制剂变为多种形 式的处理方式，有二氧化氯，有臭氧、紫外线消毒等。已 有生活水厂使用二氧化氯代替次抓酸钠进行饮用水的消毒 处理。二氧化敏是一种高效消毒剂，具有灭藻、剥泥、防 腐、抗霉、保鲜、除臭、氧化
7、和漂白作用，有广谱、高效、 速效等特点，常温下为气体 有强烈的刺激性，溶于水 可 制成不稳定的 液体“ 一 习 。研究表明， 二氧化氯消毒剂多 为实际无毒类或低毒类消毒剂，对二氧化氯消毒剂毒理学 研究多只限于初步的安全性评价。本研究对二氧化氯消毒 液进行致突变性毒理学试验，为其长期广泛应用提供安全 性毒理学评价依据。 材料与方法 ，材 料 1 . 1 二权化扳消毒液无色透明液体，有刺激性气味。比 重0 . 9 9 8 6 ( 2 0 9C测定) ，p H值为1 . 7 a实验时，用蒸馏水为 溶媒配成试验剂量浓度临用前配制 1 .2 实验动物、菌株和检测条件实验动物房合格证号: 医动字第 2 2
8、 0 0 1 0 0 1 5号。实验用I C R小鼠，由浙江省实验动 物中心提供 ( 合格证号:医动字第 2 2 0 0 1 0 0 1号) ，清洁级， 动物饲料由浙江省实验动物中心提供.执行标准 G B 1 4 9 2 4 - 作者单位:浙江名疾病预防控制 中心，浙江 杭州 3 1 0 0 0 9 2 0 0 1 。中国仓鼠肺 ( V 7 9 )细胞株由中科院细胞生物研究所 提供。检测环境条件:温度范围2 0 一2 4 9 C，相对湿度范 围 4 5 % 一 6 5 % . 2方 法 2 . 1 小鼠急性经口毒性试验剂量和染毒方式:采用一次 最大限度试验，取 2 0 只小鼠，雌雄各半。染毒前
9、，禁食过 夜， 不限制饮水。所设剂量为5 . 0 留k g 体重，用5 . 0 g 受试 物加蒸馏水配制成 1 0 . 0 . 1 ，采用 1次经口灌 胃方式，按 l o m l/ k g 体重给予染毒量。染毒后， 观察小鼠的中毒表现和 死亡情况，观察时间1 4天， 2 . 2 V 7 9细胞基因突变试验 2 . 2 . 1 阳性对照物丝裂霉素 C ( MM C ) ，甲基磺酸乙酷 ( E M S ) ，用磷酸盐缓冲液 ( P B S )稀释，终浓度为 1 P g / m l , 细胞:中国仓鼠肺 ( V 7 9 )细胞株由中科院细胞生物研究所 提供。代谢活化剂:5 9自制，于液氮中保存，临用
10、前无菌 配置。选择剂:6一T C ,终浓度为5 W . 1 ，用前滤过除菌 0 .2 5 %胰酶:用磷酸盐缓冲液配置，滤过除菌。 2 . 2 . 2 实验方法( 1 )细胞准备:将 5x1 配 个细胞接种 于底面积为5 c m x 1 O c m的培养瓶中，除未处理组外，每组 2 瓶，共 1 3 瓶。于3 7 C, 5 %C O , 培养箱中放置 24h . ( 2 )接 触受试物:吸去培养液，P B S 洗2次。将含有细胞的培养瓶 分为两大组，一组加 S 9混合液 2 . 1 ，一组不加 S 9 ，用 2 m 1 无血清培养液代替，再加人一定量不同浓度受试物的供试 液，最后用不含血清的培养液
11、补足至 1 0 . 1 。根据预实验结 浙江预防医学2 0 0 5 年第1 8 卷 第5 期 Z h e j ia n g R e v M o d , M a y 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o . 5 果发现细胞接触终浓度为5 0 0 0 p g / m l 的 样品 后状态良 好， 故 正式实验的 最高 浓度 选用5 0 0 0 1a g / n il 作为最高浓度。正式实 验设 4 个试验剂量组，终浓度分别为6 2 5 , 1 2 5 0 , 2 5 0 0和 5 0 0 0 p g / m l ,同时 设阴性对照组 ( 不含血清的培养液)和阳 性对照组 ( M M
12、C ,终浓度为1 .0 p g / m l ; E M S ,终浓度为 4 001A 岁m l ) .将培养瓶置于C 0 2培养箱中培养5 h ,结束后吸 去培养液，用P B S洗细胞2次， 换人含 1 0 %血清的培养液， 继续培养1 9- 2 2 h , ( 3 )表达:将培养物用胰酶消化，待细 胞脱落后，加人完全培养液终止消化，混匀、记数并进行 表达和细胞毒性测定。表达时，以5x 1 0 个细胞接种于底 面积为5 . m x 1 0 . 。的培养瓶中，培养 3天后，分传 1次， 仍接种5 x1 护 细胞，培养3天后再进行突变体的选择及集 落形成率 ( C F E )的测定。( 4 )细胞
13、毒性测定:将上述首次 消化计数后的细胞，每皿接种 2 0 0个，每组 5个皿，3 7 9C , 5 %二氧化碳条件下培养 7 d ，固定，G ie m s a 染色，计数各皿 集落数，以相对 C F E值表示细胞的毒性。 ( 5 )突变体的选 择及集落形成率的测定:表达结束后，消化细胞，分别接 种，每组 5 个平皿，每皿种2 x 1 0 个细胞，待细胞贴壁后 加人6 一T G ,终浓度为 5 p g / m l ，放人 C 仇 培养箱培养 7- 1 0 d后固定，G ie m a a 染色，统计各皿集落数，并计算突变频 率 ( M F ) 。按下列公式计算有关指标:绝对 C F E二形成集落
14、数/ 接种集落数;相对 C F E = ( 实验组绝对C F E / 溶剂对照组 绝对 C F E ) x 1 0 0 %:突变频率 ( M F )二 ( 突变集落数/ 接 种细胞数)x ( I / 绝对C F E ) 2. 3 小鼠骨髓细胞微核试验 2 . 3 . 1 实验动物I C R小鼠，体重 2 5 - 3 0 g ,雌、雄各半。 2 . 3 . 2 荆且和给药方法 试验设0 . 5 , 2 .0 和5 . 0 岁k g 体重 3 个剂量组。另设阴性对照 蒸馏水)和阳性对照组 ( 环磷 酸胺6 0 盯吨体重) ， 每组1 0 只小鼠 。采用间隔2 4 小时2 次 给予二氧化抓消毒剂，末
15、次给予后 6 h 处死动物，取其胸骨 骨髓制片，甲醇固定，G ie m -染色。 2 . 3 . 3 观察摺标镜检时每只动物计数 1 0 0 0个嗜多染红 细胞 ( P C E ) ，计算微核千分率 ( M N % o ) o 2 . 4 小鼠精子畸形试验 2 . 4， 实验动物雄性I C R小鼠，体重2 5 一 3 5 g . 2 . 4 . 2 荆皿和给药方法试验设。 . 5 , 2 . 。和5。 岁k g 体重 3 个剂量组，用蒸馏水配制。另设阴性对照 ( 蒸馏水)和阳 性对照组 丝裂霉索C 1 . 5 g / k g 体重) 。每组， 只雄性小鼠。 二氧化抓消毒剂以灌胃方式给予，连续
16、5天，对照组也相 同处理，在首次给予的第3 5天，颈椎脱臼处死小鼠，随机 选5 只小鼠取二侧附翠，放人盛有适量的生理盐水的平皿 中，用眼科剪将附肇剪碎，四层擦镜纸吸滤，直接涂片， 自然干燥，甲醉固定，用 1 %伊红染色。 2 . 4 . 3 观察指标高倍镜下检查精干形态，每只小鼠检查 完整精子 1 0 0 0 个，记录畸变精子类型和数目，计算精子畸 形率 ( %) 。 3统 计 方法采 用 “ N S 1 0 . 0 f . , Wind-统 计 教 件 对 牢 盼 数 据 进 行 分 析 结果 1 二徽化级消毒剂小鼠急性经口毒性试验结果染毒后， 未见实验小鼠有中毒表现和死亡情况出现，观察期满
17、处死 动物，大体解剖未发现组织或脏器有明显异常改变。二氧 化抓消毒剂对小鼠 急性经口L D .雌雄两性均大于5 . O g / k g 体重，根据急性毒性分级标准，属干实际无毒类。 2 =级化氮消毒剂V 7 9 细胞基因突变试验结果各剂量组 集落形成率，相对集落形成率，突变频率，见表 1 , 2 。各 剂量组与阴性对照组相 比突变频率差别均无显著性 ( P 0 . 0 5 ) 。未见该二氧化氯消毒剂对V 7 9细胞H G P R T系统有致 突 变 性 。 表 1 消毒剂对 V 7 9 细胞毒性试验 3 5 ) 组别 剂量平均集 落数绝对 C F E 相对 C F E S 9 ( p 8 /
18、. 1 )( 个 )( %)( %) 未 处理组 阴 性对照 E MS M M C 受试物 / +/ / 十礴 0) 一4 0 +1 一1 +5仪 目 一5 0 0 0 +2 5 加 2 5 0 0 +1 2 5 0 一1 2 5 0 +6 2 5 _石 2 5 1 6 5 . 2土3 . 3 1 58. 2 上 5. 8 1 6 5. 4 x 5 . 7 1 2 1.4土4 . 9 1 1 8 . 4 + 4 . 7 1 2 3 . 6士4 . 0 1 1 9 . 2土6 . 8 1 5 3 . 0士5 . 0 1 0 7 . 0 x 8. 2 1 5 3 . 4 .5. 2 13 2. 0
19、士 4. 8 1 5 1 . 2 士3 . 0 1 4 2 . 0 士5 . 8 1 5 3 . 8 t 4 . 4 1 3 0 . 8 .5 . 7 8 2. 6 7 9 . 1 8 2 . 7 6 0. 7 5 9 . 2 6 1 . 8 5 9. 6 7 6 . 5 5 3 . 5 7 6 . 7 6 6 . 0 7 5 . 6 7 1 . 0 7 6. 9 7 5_ 4 1 0 0 . 0 1 00. 0 7 6 . 7 7 1 . 6 7 8 . 1 72. 1 9 6 . 7 6 4_ 7 9 7 . 0 7 9 . 8 95. 6 8 5 . 9 9 7 . 2 91 2 检测
20、细胞数为 2 0 (个 / 皿 表 2 消毒剂对 V 7 9细胞毒性试验 组 别 剂量突变集落总数M F k g lm l)( 个 )( 个/ 1 0 ) P 值 1016153594481191121714221717扭1616 /绷姗，、侧溯绷绷脱脱625625 未处 理组 阴 性 对 照 FM 三 M M 受试 物 1 2 . 1 2 0 . 2 2 1 . 8 5 9 1.4 7 5 6 . 8 1 9 2 . 6 1 8 7 . 9 2 2 . 2 2 6 . 2 2 8 . 7 2 5 . 8 2 2 5 呈5_ 4 2 0 . 8 21 2 F 0. 5 P0. 5 0 . 2
21、, P 0. 5 P0. 5 P 0. 5 P 0. 5 P 0. 5 注 : 检测 细胞数 为 2 x l 0 / 皿 ;本实 验数据 服从 P o i . 。 分 布 ， 2 0 , 故 用 u 检验 进行分 析 : u 二 X 1 一X 2 ) / ( X I + X 2 ) “ 浙江预防医学2 0 0 5 年第1 8 卷第5 期 Z h e ji a n g P m v M e d , M a y 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o . 5 3二 氛 化 抓 消 番 刑 小 眼 骨 公 FA 胞 敬 极 试 以 结 果谷 荆 量 组 与阴性对 照组 比较微核率差别均无显
22、著性 ( P0 . 0 5 ) , P C E / N C E均 0 . 1 。小鼠骨髓细胞嗜多染红细胞微核试验结 果为阴性，见表3 。二氧化氯消毒剂对小鼠骨髓嗜多染红细 胞 无 致 微 核 作 用 表 3 消毒剂小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 性别组 别I 1 A l g l k g J 鼠数 受 检 P E C数 ( 只 ) 含微核 P C E 数 微 核细胞率 ( 知 1 P C E / N I F 1 . 4 z 0 . 9 2 . 2 土 1 . 9 1 . 6 s 1 . 8 2. 0上 0. 7 2 3 . 4 : 4 . 7 “ 1. 6土 1. 1 1 . 4 士0. 9 1
23、. 6 士 L5 l . 4 土0. 9 2 1 . 6 士4 . 9 0 . 8 7 0 0. 41 7 0 . 7 8 0 / 0 .0 5 ) 。二氧化氯消毒剂小鼠精子畸形试验结果为阴性。 表 4消毒剂对 小鼠精子畸形试 验 畸形精子 数 个) 组别无 钩胖 头香蕉双头/ 双 尾折叠无 定形 d ip 畸形率 L 肠 J 个数构 成比个数构成 比个数构成 比个数构成 比个数构 成比个数构成 比 14222022J6 1111几林j 印7062肠64 阴性对照 ( H , o ) 受试物0 .5 g l k g 2 .O g f k g 5 .O g l k g 丝裂锡素c 2 .O g
24、l k g 0. 3 3 0. 3 3 0. 3 8 0. 3 3 0 . 38 0 . 0 2 0. 0 3 0. 0 3 0 . 0 5 0. 03 。 的 0. 0 2 0 . 0 3 0. 0 7 0. 0 5 0. 0 4 0 . 0 5 0 . 0 3 0 . 0 2 0 03 。 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0_ 00 0 . 5 3 0 . 5 7 0 . 5 2 0 . 5 4 0. 5 2 2 . 2 8 2 . 4 4 Z t 如 2 . 44 6 32 北叨464020 注 :鼠数 5 ; 受 检精子数 个)5 0 0 0 ; . 与阴性对
25、照组 比较 ，p 0 . 0 1 讨论 二氧化氯是一种水溶性的强氧化剂。其氧化能力是氛 气的2 . 6 倍。灭菌效果是次抓酸钠的5 倍。二氧化抓代替次 抓酸钠作为饮用水消毒剂的换代产品，杀菌作用快速，使 用浓度低，同时降低致癌物质三抓甲烷、四抓化碳的形成 还可除去水中的无机物和异味，消毒作用后残留生成物为 水、氯化钠和微量二氧化碳、有机糖等无毒物质。因此二 氧化抓在饮用水消毒中有许多独特的优越性 t o f 。初步的 毒理学研究表明，二氧化氯消毒剂多为实际无毒类或低毒 类消毒剂。为了二氧化抓消毒液长期广泛的安全应用，有 必要对其进行致突变性毒理学试验以提供安全性毒理学评 价依据。本次研究对象二
26、氧化抓消毒剂小鼠雌雄两性急性 经口山。 均大于5 . 0 g / k g 体重， 为实际无毒类。致突变试验 的原则是原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内 和体外试验相结合，本研究选用小鼠骨髓细胞微核试验、 小鼠精子畸形试验和 V 7 9细胞基因突变试验。本研究小鼠 骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验最高剂量设为5 . 0 g / k g 体重，同时 设2 。 和。 .5 酬k g 体重共三个剂量组， 实验结 果表明3剂量组二氧化抓消毒剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞 无致微核作用，小鼠精子畸形试验结果为阴性。V 7 9细胞 基因突变试验设6 2 5 , 1 2 5 0 , 2 5 0 0 和5
27、0 0 0 H g / tn l 四个剂量组， 各剂量组突变频率与阴性对照组相比差别均无显著性。综 上所述，本研究显示二氧化氯消毒剂在本实验系统条件中 无致突变作用。 参考文献 【 上 于立武二氧 化级 消毒 剂在生 活饮 用 水中 应 用情 况分 析 t . 现代预防医学，2 0 0 4 . 3 1 ( 1 ) : 7 1 - 7 2 . 2 M ic h a e l G E , M id a y B K , B e z e z 1 P , e t a l . C h lo r i te d i o x i d e w a t e r d i s in fe a i o n : A p ro p x t iv e .p id e 1, 1, g y st u d y仁 J 1 . A m h E n v iro m H e a l t h. 1 9 8 1 . 3 6 : 2 0 3 王衍ti .， 黄 昌和 ，陈 婷 ， 等 .万德牌 二氧化 抓消 毒剂 的杀 菌效 果观察 S 广西 预防IK学 ，2 0 0 1 , 7 ( 1 ) ; 3 4 - 3 5 收 稿 日 期 : 2 0 0 5 - 0 7 - 2 5 )