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1、2005年第32卷第11期 人 N“#$%?= A$2$ Zhang WenminXiao GangZhang Menget al Department of Pathology, Zhongshan Medical College of Sun Yat-sen University, uangzhou 9B1+1:pGEX4T-1空 质 粒EcoRI单 酶 切 ;2: pGEX/ESO1重组质粒EcoRI单酶切;3:pGEX/ESO1重组质粒 EcoRI/XhoI双酶切;4:pGEX/ESO1重组质粒PCR 图1pGEX/ESO1重组质粒PCR和酶切分析 M:低分子量蛋白Marker;1:p
2、GEX4T-1诱导前;2:pGEX4T- 1诱导后3:pGEX/ESO1重组质粒诱导前;45:pGEX/ESO1 重组质粒诱导4h;67:融合蛋白亲和层析纯化后 图2pGEX/ESO1重组质粒诱导表达和纯化 图3纯化的融合蛋白western blot鉴定 2.4肝细胞癌患者血清ELISA检测 将50份肝癌患者血清和20份正常人血清按 1:100、1:500、1:1000、1:5000稀释后加入到用NY- ESO-1蛋白包被的ELISA板,以1:500为最适稀释 度。正常人血清A450值为0.055 30.019 1,肝癌患者 中4例血清NY-ESO-1抗体阳性(8%),A450值分别 为0.2
3、18 4、0.184 2、0.205 4、0.162 4。 3讨论 随着免疫学、 分子生物学与基因工程技术的发 展,多种肿瘤抗原的发现,肿瘤免疫治疗再度成为国 际上肿 瘤 治 疗 的 热 点 之 一 。1997年Chen利 用 SEREX技术,在食管癌中首次鉴定出NY-ESO-1基 因并命名之6,该基因定位于人染色体Xq28上,其 转录单位大小约0.8kD,含3个外显子。NY-ESO-1 基因编码180个氨基酸, 分子量约18kD。 已证实 NY-ESO-1不表达于人体正常组织 (睾丸除外),而 在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和肝细胞癌等多 种肿瘤组织中特异表达7,8。 多项研究表明NY-E
4、SO-1免疫原性极强,这可 能与它存在多个表位有关,在NY-ESO-1蛋白中现 已知有多个HLA-I类和II类识别的表位9,10,并不 断有新表位的发现。 用自行设计的引物用RT-PCR 方法从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1 3端276bp 片段,并成功导入pGEX4T-1原核表达质粒,表达 GST-ESO1融合蛋白, 该段蛋白不仅含有HLAI、 HLAII识别的表位, 还有同时识别二者的表位,因 此,以该段蛋白做成疫苗不仅可保存NY-ESO-1蛋 白的强免疫原性,还克服了HLA表型的限制,在肿 瘤的免疫治疗中将起重要作用。 本研究选用BL21(DE3)大肠杆菌作为宿主细 胞,对目的基因进行
5、原核表达,因BL21(DE3)缺乏 纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶和ompT外膜蛋 白酶11,所表达的目的蛋白有较高的稳定性。本实验 表达的蛋白经多次优化后, 仍以不溶性的包涵体形 式存在,为了使包涵体恢复生物学活性,我们采用透 析法复性,将变性的蛋白质装入14kD的透析袋中, 通过逐渐降低外透液浓度, 缓慢去除变性剂使目的 蛋白恢复到正常的折叠结构。 我们所表达的蛋白含 GST标签,通过GST亲和层析可以方便得到较高纯 度的融合蛋白。 肝癌是我国高发的恶性肿瘤, 肝癌免疫治疗是 一种极有应用前景的治疗方法,已有文献报道NY- ESO-1基因在肝癌中表达 12, 但免疫机制尚不清 楚。Kor
6、angy13首次在肝癌患者血清中检测到NY- ESO-1抗体,阳性率为10%,并发现NY-ESO-1血 清抗体滴度与病情进展关系密切, 有利于判断病情 的进展情况。 因NY-ESO-1抗原难以得到,国内未 见相关文献报道,我们利用表达的NY-ESO-1融合 人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用633 中国肿瘤临床2005年第32卷第11期 蛋白,应用ELISA技术检测到国内肝癌患者血清中 也存在NY-ESO-1抗体, 证实了肝癌患者体内有 NY-ESO-1特异性的体液免疫反应。另外,商品化的 NY-ESO-1抗体很少, 实验及临床研究仍多采用 RT-PCR检测NY-ESO-1基因的
7、表达,我们得到的 目的蛋白可用于NY-ESO-1抗血清的制备,为进一 步研究NY-ESO-1抗原在免疫治疗中的作用奠定 基础。 参考文献 !“#$%12$ ;/%! 4%2*#%,131, ;7*#*1Z% *1+2 3#,*+28% #$#128* ,#2,%;*1% %;1*+;%8A“BC “ .d; e%( KSSfF KOgTNTI9Q TgH PE+4%+28% *+ ?=.)X=KN ;/%NgIIQggT 9)*+,-%/% ,#2,%+*%2*1#/ *#*1, bcW=WT %;1*+;% #3*%;*1% 144721p#*1+2 +3 ,#2,%#*1%2*8 A“BC h_ %2,+%8 *77! +2*#2%+78 *74+%,131, ,%/7/#+28%8 *+ ?=.)X=K 12 ?:!(!*ABCDEFC 634