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1、9 i t 著 人一猪链球菌感染性综合征的病原分离与鉴定 杨华富， 朱凤才， 史智扬， 庄菱， 顾玲， 郭喜玲， 张春元， 陈太基 ( 江苏省疾病预防控制中心， 江苏 南京2 1 0 0 0 9 ) 摘要】 目的: 分离和鉴定猪链球菌， 为诊断和治疗提供科学依据。 方法: 用3 种增菌液和7 种培 养基对病人血液、 脑脊液培养和病死猪的内 脏培养， 并对分离到的病原体进行染色形态观察、 A P I S t r e p 2 0 生化及其它生化试验、 血清凝集试验。 结果: 从4 例病人血液、 1 例脑脊液和7 例病死猪中 分离到1 2 株病原 菌， 经鉴定9 株编码为。 6 4 1 4 5 3
2、, 2 株为0 6 4 0 4 5 3 , 1 株为1 6 4 1 4 5 3 , 1 2 株菌 均与猪链球菌2 型血清凝集。 结 论: 1 2 株细菌均为猪链球菌2 型。 【关 键 词 】 猪链球菌; A P I 生化试验; 凝集试验 【 中图分类号 R -3 3 文献标识码】 A 文章编号 1 0 0 6 一9 0 7 0 ( 2 0 0 1 ) 0 4 - 0 0 0 9 一0 2 I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f s t r e p t o c o c c u s s u i s Y I N G Hu a -
3、f u , Z HU F e n g - c a i ， S HI Z h i -y a n g , e t a l . ( J i a n g s u P r o v i n c e C e n t e r f o r P r e v e n t i o n a n d D i s e a s e C o n t r o l , N a n j i n g 2 1 0 0 0 9 , C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t iv e : I s o l a t i o n a n d i d e n t i f ic a t io n o f s t
4、r e p t o c o c c u s s u i s . Me t h o d s : T h e b l o o d a n d c e r e b r o s p i n a l fl u i d ( C S F ) w e r e t a k e n f r o m i n f e c t e d p e o p l e , w h o d e t e c t e d b y b l o o d n u t r i e n t a g a r m e d i u m, a n d c a u s a t i v e o r g a n i s m w e r e o b s e r
5、 v e d b y t h e s h a r p o f t h e o r g a n i s m, A P I S t r e p b io c h e m ic a l t e s t s a n d r e f e r - e n c e s e r u m c o a g u l a t e t e s t s . R e s u l t s : 1 2 s t r a i n s o f s t r e p t o c o c c u s w e r e i s o l a t e d f r o m 4 s e r a a n d 1 C S F o f t h e i n
6、f e c t e d m e n , a n d 7 v i s c u s s a m p l e s w e r e i s o l a t e d f r o m p i g i l l - d e a t h . B y A P I 2 0 S t r e p t e s t , t h e c o d e o f 9 s t r a i n s w a s 0 6 4 1 4 5 3 , t h e a n o t h e r t w o c o d e o f s t r a i n w a s 0 6 4 0 4 5 3 , a l l t h e 1 2 s t r a i
7、n s w e r e c o a g u l a t e d w it h t h e r e f e r e n c e s e r a o f S . s u i s . C o n c l u s i o n 1 2 s t r a i n s o f S t r e p t o c o c c u s w e r e S . s u i s . K e y Wo r d s S . s u i s ; A P I b i o c h e m i c a l t e s t ; s e r u m c o a g u l a t e t e s t 1 9 9 8 年7 月下旬， 江苏
8、某地发生了 几十例原因不明的急性 中毒性休克综合征病人， 死亡1 4 例。与之同时， 当地也发生了 数万头生猪死亡。 病人病情发展快， 病死率高。 鉴于病原体的检 出结果对疾病预防控制的重要性， 我们选用了多种培养基对病 人的血液和脑脊液及病死猪的内脏标本进行了病原体分离。 分 离到的病原体染色形态多变， 为此采用了人工生化、 A P I 2 0 s t r e p t 生 化 条、 和 血 清 凝 集 试 验 进 行 菌 种 鉴 定， 从中 找 到了 一 种 可靠的生化鉴定猪链球菌的方法， 报道如下。 1 材料与方法 1 . 1 标本来源医院临床病人的血液、 脑脊液和病死猪的内 脏( 肝、
9、脾、 肺、 淋巴结等) 。 1 . 2 分离培养方法 将无菌操作采集的血液、 脑脊液和病死 猪的内脏标本接种到肉汤增菌液、 L型肉汤增菌液、 碱性蛋白 陈 水， M A C琼脂培养基、 S S 琼脂培养基、 山梨醇MA C琼脂培养 基、 T C B S 琼脂培养基、 L型琼脂培养基、 含8 %小牛血清营养琼 脂培养基、 含8 % 脱纤维羊血营养琼脂培养基， 放入3 7 培养箱 2 4 4 8 小时， 挑取菌落进行革兰染色并在显微镜下观察细菌形 态。 1 . 3 细菌生化鉴定挑取单个菌落转8 %小牛血清营养琼脂 平板， 3 7 培养2 4 小时， 刮取菌苔制备菌液( 浓度为麦氏4 度) 供A P
10、 I 2 0 S t r e p 生化 条及其他生化 试验用。 ( 1 ) 人工生化试验: 生化试验管购自 浙江省军区后勤部卫 生防疫检疫所( 批号 9 7 1 1 0 6 一9 8 0 7 0 4 ) ; 将菌液加入各生化管， 每管加2 0 -3 0 p l 菌液， 3 7 培养2 4 - 7 2 小时加入相应试剂并 观察结果。 ( 2 ) A P I 生化试验: A P 1 2 0 S t r e p生化系统购自 法国生物 一梅里埃公司( 批号 7 2 8 6 1 9 2 0 1 ) ， 将菌液加入到 V P精氨酸 A D H管中， 每孔加1 5 0 ji l 菌液， 另取。 . 5 m
11、1 菌液加入到A P I A - T R E P培养基中， 均匀后吸取 1 7 0 f d 加入到核糖R I B糖原 G L Y P 管中， 并用无菌石腊覆盖A D H到A L Y P 管上， 形成一个 凸面， 放在含有5 m 1 水的培养盒内， 3 7 培养4 小时， 加入相应 试剂， 1 0 分钟后观察结果。2 4 小时观察糖发酵试验结果， 根据 结果进行编码， 查A P I 2 0 S t r e p生化系统编码表。 1 . 4 血清凝集试验标准猪链球菌1 型和2 型血清来自 荷兰 收稿日 期: 2 0 0 1 -0 7 - 0 5 作者简介: 杨华富( 1 9 6 4 一) ， 男，
12、江苏高淳人， 主管技师。 1 0. D L O 一I n s t i t i d e f o r A n i m a l H e a l t h a n d S c i e n c e 2 ， 猪链球菌 2 型 ( S S 2 ) 参考菌株来自德国吉森大学， 均由南京农业大学国家重 点微生物实验室提供。 将培养2 4 小时的细菌制备成浓菌悬液， 加一滴菌液和一滴血清于玻片上混匀， 1 分钟内观察结果。 同时 设生理盐水对照。 2 结果 2 . 1 菌 株的分离及特性从4 例病人血液、 1 例病人脑脊液和 7 头病死猪内 脏标本中分离到1 2 株细菌。 该菌在肉 汤培养基中 浑浊生长， 底部有沉
13、淀， 8 %小牛血清营养琼脂和8 %脱纤维羊 血营养琼脂生长良 好， MA C , S S 、 山梨醇M A C , T B C S 和L型琼 脂培养基不生长。 2 . 2 菌落形态及生长试验特性该菌在血平板上呈细小菌 落， 无色， 半透明， 直径 0 . 5 -l m m， 边缘整齐， 凸起， 光滑, a 溶 血。 革兰阳性链状球菌， 无芽胞， 无英膜。 该菌1 0 培养不生长， 4 5 培养生长， 6 0 C 3 0 分钟试验不生长。 p H 9 . 6 肉 汤生长， l o o 美兰牛乳、 4 0 %胆汁肉汤和6 . 5 0 o 氯化钠肉汤不生长。 2 . 3 微童生化试验 水解七叶 昔
14、、 淀粉和精氨酸 ， 不水解马 尿 酸盐和明 胶。 分解乳糖、 葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖和甘露糖， 不分 解 阿拉伯糖、 鼠 李糖、 山 梨醇和甘露醇。 2 . 4 A P I 生化生化试验1 2 株链球菌A P I 2 0 S t r e p 生化结 果 经编码9 株为0 6 4 1 4 5 3 , 2 株为0 6 4 0 4 5 3 , 1 株为1 6 4 1 4 5 3 。 查编 码 表1 2 株细菌均为猪链球菌2 型。 其中编码0 6 4 1 4 5 3 猪链球菌2 型的鉴定百分率为 9 9 . 9 0 o ， 编码 0 6 4 0 4 5 3 猪链球菌2 型鉴定百 分率为9 9 .
15、8 0 o ， 编码4 6 4 1 4 5 3 猪链球菌2 型的鉴定百分率为 9 9 . 9 %， 猪链球菌2 型参考菌株S S 2 的编码为4 6 4 0 4 7 3 ， 鉴定 百 分率为9 9 . 9 %e A P I 生化结果详见附表。 2 . 5 血清凝集试验 1 2 株细菌和猪链球菌S S 2 参考菌株 均与 猪链球菌2 型参考血清凝集， 与猪链球菌1 型参考血清不凝集， 生理盐水对照阴性。 附表 分离菌株A P I 链球菌系统检测结果 菌株 生化试验 A B C S S 2 菌 株 ” 生化试验 !A B C S S 2 1 . V P一一_ 2 . 马尿酸盐一一_一 3 . 七叶
16、灵一一十+ 4 . 毗咯酮基芳胺酶一一一一 5 . 。 一 半乳糖酶+十+ 6 . p - 葡萄糖醛酸酶+ 7 . R 一 半乳糖酶一一一一 8 . 碱性磷酸酶一一一一 9 . 亮氨酸芳胺酶+ 1 0 . 精氨酸双水解酶十一+一 n .核 糖- 1 3. 阿 拉伯 糖一一一 1 .14 甘 豁- 1 4 . 山 梨 醇一一一 1 二U l +十十+ 1 5 . 扎裙丁 1 c a fa s V r A&+十+ 1 7 _ 菊根粉一一一+ 1 。怕T r+十+ l k - #m于裙-T- ， n冲仍+十 1 9 . 二宇十十 2 0 . 棺原下 1 . a -溶血一一一 一IJ刁J飞 11勺山O
17、J 厂LL-LFL 3 讨论 猪链球菌可引起人和动物多种疾病， 人感染链球菌严重者 可导致中毒休克综合征并引起死亡， 国外已 有报道 1 - 3 1 。 这次江 苏某地发生的猪链球菌中毒性休克综合征病人病情凶恶， 潜伏 期短， 病程快， 病死率高。 早期临床诊断凝为: 炭疽病、 流行性出 血热、 钩体病、 链球菌引起的猪肺疫及0 1 5 7 : H 7 出血性大肠杆 菌等细菌性病原体引起的疾病。 因此病原体的分离和鉴定对疾 病的确诊、 预防和控制十分重要。 本次分离的猪链球菌， 刚分离时细菌形态为典型的革兰阳 性链球菌， 链长达二十多个， 二代培养后细菌染色形态发生变 化， 多为革兰阴性球杆球
18、， 不成链， 给细菌鉴定带来一定困难。 因此刚分离到的细菌形态观察对细菌鉴定十分重要。 链球菌血清群繁多， 其感染宿主和致病力也不相同， 因此 链球菌的型别鉴定十分重要。 我们根据伯杰细菌鉴定手册， 选 择了2 4 个生化指标对本次分离的菌株进行鉴定， 由于链球菌 属内的各型链球菌间的生化结果差异不大， 结果未能定种， 用 MA S -3 0 0 微生物自 动生化分析仪， 也由 于机内 贮存标准菌有 限， 未能定种。 A P I 2 0 S t r e p 生化系统将该菌鉴定， 结果鉴定率 大于9 9 . 8 %， 均为猪链球菌2 型。 血清凝集试验结果也证实了 菌株为猪链球菌2 型。因此A
19、P I 2 0 S t r e p生化系统可作为生化 鉴定猪链球菌的一个快速方法。 不同的生化试验方法， 少许生化结果不一样， 这可能与接 种的菌量有一定的关系。 水解七叶昔可因方法的相异而不同。 由于链球菌的生化特性变化较大， 从菌体形态和常规生化 试验难以进行菌种的鉴定。 用A P I 2 0 S t r e p 生化系统对本次分 离到的链球菌进行了种的鉴定， 取得了满意的结果， 这对以后 同类细菌鉴定提供了可借鉴的经验。 姜淑贤， 尚 德秋. 链球菌中 毒休克综合征和超抗原 J . 中国 公共卫 生， 1 9 9 6 , 1 2 ( 2 ) : 9 2 -9 4 . We i s s K A . G r o u p A S t r e p o c o c o o s i n v a s iv e i n f e c t i o n s : a r e v ie s J . C a n J S u r g , 1 9 9 7 , 4 0 : 1 8 - 2 5 . 阎世德， 姜淑贤， 陆桂珍. 国外A群链球菌病的流行病学研究 J 7 . 疾病监测， 1 9 9 6 , 1 1 : 2 6 一3 1 .