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1、第2 6 卷第6 期 2O08 年6 月 中华中医药学刊 C H I N E S EA R C H I V E SO FT R A D l T l O N A LC H I N E S EM E D I C I N E V 0 1 2 6N o 6 J u n 2OO8 人参总皂苷体外诱导大鼠 骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞 郑国庆，王小同，邬伟，陈伟，宋秋英 ( 温州医学院附属第二医院脑科中心康复中心，浙江温州3 2 5 0 2 7 ) 摘要：目的：探讨人参总皂苷体外诱导青年s D 大鼠骨髓问质干细胞( M s c s ) 分化为神经元样细胞的作用。 方法：贴壁筛选法分高纯化M s c
2、s 。1 0 帖L “b F G F 预诱导第5 代的M s c s 2 4 h ，换2 0 0 斗g m L “人参总皂苷的无 血清培养液诱导诱导5 6 h ，观察细胞形态变化，免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化酶( N s E ) 、微管联合 蛋白一2 ( M A P 一2 ) 、胶质纤维酸性蛋白( C n 心) 的表达。结果：第5 代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用人 参总皂苷诱导3 0 I l l i n 到3 h 后，M s c s 胞体逐渐增大，并伸出细长突起形似神经元样细胞。诱导5 6 h 后，N S E 、 M A P 一2 和G F A P 阳性细胞数分别为( 7 6 4
3、 7 ) 、( 6 l 5 2 ) 、( 1 0 2 4 ) 。对照组上述染色均呈阴性。结 论：人参总皂苷在体外能定向诱导M s c s 分化为神经元样细胞。 关键词：人参总皂苷；骨髓间质干细胞；神经元样细胞；细胞分化 中图分类号：R 一3 3 文献标识码：A文章编号：1 6 7 3 7 7 1 7 ( 2 0 0 8 ) 0 6 一1 2 5 7 0 3 C o m m i t c e dD 竹e r e n t j a t o nF r o mM e s e n c h y m a IS t e mC e so f R a tI n t 0N e u r o n 一| I k eC e s
4、I n d u c e db yT 0 t a IS a p o 几i n s0 fP a n a xG i n s e n gi nV i t r O z H E N CG u o - q i n g ，w A N Gx i t o r 唱，1 盯UW 裔，C H E N Cw 色i ，S O N GQ i u y i n ( D e p 丑n m to fN m l o 留c e n t e r r e h 且b i l i h t i c e n t e r ，t h cs e c o n dA 仿l i a t e dH o 叩i t a lo fw c n z I 叫 M e d j
5、 c a lC o l l e 伊w 2 l l o u3 2 5 0 2 7 ，办e j i a n g ，C h i u ) A b s t 限c t ：O 蜘c 如e ：T bi n v e s t i g a t et h ec o m m i t t e dd i f e r e n t i a t i o fm e 鸵n c h y m ls t e mc e l l s ( M s C s ) o fy o u n gr a ti n t o 眦u 咖一l i k ec e u s 耐I ht o l a ls a p o n i n so fp 蚰a 】【g i n s e n
6、 g ( 俗P G ) i nV i t m 知，l D 出：T oi l a t et h en u c l e a t e dc e u sf m m b o 眦m a m 删0 fy o u T l gm t t h r o u 曲a d h e r e n t D n i n gm e t h o d ，t h e nc u l t u 剐t h e ma n dr e m o v e dt h eu n a d h e r e n tc e u s ，t h e n g D tp u 陀M S C s 1 1 l e5 t hp 船s a g eo fM S C 8w e mp r
7、e i r I d u c e d1 0 斗g - L _ 1b F G Ff 打2 4h ，t h e nt l l em e d i u mw 髓r e p l a c e d 埘t ht h e 靶兀珊一f r e ei n d u c t i o nm e d i ac o n t a i n i n g2 0 0 u 属m L _ 1 髑P Gf 撕5 6 h T h ed i f e r e n t i a t e dc e U sw e r eo b r v e d w i t hp h a 一c o n t r 船tI r I i c r c o p y 鲫dd e t e c
8、 t e dt I l ee x p r e s s i o f8 e v e r a ls p e c 击cP r o t e i n s ，s u c h n e u m n s p e c i f i ce n o l 锄e ( N S E ) ，I n j c r o t u b I l l e 一船s o c i a t e dp m t e i n 一2 ( M A P 一2 ) 蚰d 咖a l 肺r i U a r ya c i d i cp r o t e i n ( G F A P ) w i t hi m m u n o h i s t o c h e m - i c a
9、lm e t h o d 尺e j u 垴：M S C sw e r ec o m s e das j n g l ep h e n o t y p i cp o p I l l a t i a n dd i s p l a y e da 硒m b l 8 s t l i k em 呷h o l 啊 止e r5 t hp 幽s a g ei nc t d t u r e 1 1 l ei n d u c e dM S c s 乎耐u a u yt 岍I e di n t 0t h en e u r o n l i k ec e u si nt h ei n d u c t i 叽g r o u
10、 p s 舶m t I ef i r s th a l fa nh o u rt o3h T h en e u m n l i k ec e U se x p r e s s e dN S E ，M A P 一2 蛐dG F A Pp i t i v e T h ep e r c e n t 珥r e so f 陀 5 p o n s i v ec e u sp o s i t i v ef o rN S E ，M A P 一2 卸dG F A Pw e r e ( 7 6 4 7 ) 、( 6 l 5 2 ) 蛐d ( 1 0 2 4 ) r e s p e c t j v e l y 止
11、t e r5 6 ho fi n d u c t i o n 1 1 1 e 佃m s p o n s i v ec e u si nt h ei n d u c t i g m u p 蛐dt h o 驼c I l l t u r e dc e l l si nt h ec o n t m lw e r es h o w I I n c g a t i v ef o ra l lo ft h ef o r m e rd e 吮t e dm a r k e 墙c D 几c Z w 如厅：1 1 l eM S c sc o u l db ed d 瞻r e n t i a t e di n t
12、on e u 啪一l i k ec e l l si n “t m “I ht h ei n d u c t i o f 巧P Gi nt h ef b e 一8 e 咖m e d i a K e y w o r d s ：t o t a l8 叩l o r I i n so fP 咖g i n s e n g ；I I 砖n c h y a ls t e mc e n ；n e u r o n s ；n e u r o n 一1 i k ec e U s ；c e Ud i f e r e n t i a t i o n 问充质干细胞( m e n c h y m a ls t e mc e
13、 u s ，M s c s ) 是一类 具有强大自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在特定条 件下可分化为神经细胞、心肌细胞、肝细胞等。骨髓是 M S c s 最重要的来源，取材容易，且能迅速培养、增殖，弥补 了神经干细胞取材困难的特点，自体移植又避免了免疫排 斥反应，亦无胚胎干细胞的伦理学问题，因而作为移植的重 收稿日期：2 ( 1 0 8 0 l 1 8 基金项目：浙江省卫生厅课题( 2 0 0 6 B 1 0 3 ) ；温州市科技局课题 ( Y 2 0 0 4 A 1 5 4 ) 作者简介：郑国庆( 1 9 7 5 一) ，男，浙江温岭人副教授，博士，硕士研 究生导师，主要从事中西医结合神
14、经病学研究。 要种子细胞来源，用于中枢神经系统疾病或损伤的细胞治 疗，具有广阔的应用前景。人参总皂苷有着广泛的药理作 用，能稳定神经细胞膜，保护突触结构、增加突触数目，对神 经递质的影响及抑制神经毒性作用，抗氧化、抗凋亡和抗应 五 激作用等，其可能对M S C s 的增殖和定向诱导分化具有 中 促进作用。本研究旨在探讨人参总皂苷作为诱导剂对霪 M S C s 体外定向诱导分化为神经元样细胞的影响，为人参总二= 一 皂苷的临床应用及将M S c s 用作细胞替代疗法的种子细胞 1 2 5 7 提供良好的理论和实验依据。 坐 1 材料与方法刊 1 1 贴壁筛选法分离培养M s c s 取青年s D
15、 大鼠，体重 8 0 一1 0 0 9 ，雌雄不限，腹腔下注射水合氯醛O 3 m L l o o g ， 万方数据 第2 6 卷第6 期 2 0 08 年6 月 中华 C H I N E S EA R C H I V E S 中医药 O FT R A D I T l O N A L 学刊 C H I N E S EM E D I C l N E V 0 1 2 6N o 6 J u n 2O O8 麻醉后脱颈处死，置于7 5 酒精中浸泡5 m i n 以上，无菌条 件下取出双侧股骨、胫骨，以l m L 注射器，抽取培养液5 1 0 m L ，反复冲洗髓腔，将冲洗液收集于离心管中，1 0 0 0
16、 r m i n 离心8 m i n 。去除上清液，D M E M F 1 2 培养液适当稀释沉淀 后，种植于含有2 0 胎牛血清、1 双抗( 青霉素、链霉素) 的D M E F 1 2 培养液( 即完全培养液) 的培养瓶内，在 3 7 ，5 C 0 2 ，1 0 0 饱和湿度条件下进行细胞箱培养。3 天第1 次换液，弃上清液，除去非贴壁细胞，同时更换新鲜 的培养液，内含1 0 F B s 。根据细胞生长情况，每3 5 天， 全量更换培养液。M s C s 细胞生长8 0 一9 0 融合后，消 化传代，以O 2 5 胰酶，1m ME D T A 消化5 一1 5 m i n 后，以 含血清培养
17、液中止消化，吸管吹打瓶壁未消化细胞，细胞悬 液离心，1 0 0 0r m i n ，1 0 m j n ，倾倒上清，将细胞团吹散，1 ：3 重新接种培养。细胞形态在倒置显微镜下观察。选取第5 代生长良好细胞进行实验。 1 2 M S c s 神经分化诱导选用5 代的M s c s 进行诱导分 化，以2 5 1 0 5 m L 接种到6 孔培养板中，细胞达8 0 融 合时，弃培养液，加入含1 0 嵋L “b F G F 的完全培养液预 诱导2 4h ，用P B s 洗3 次，更换成含2 0 0 峭m L 。1 人参皂苷 的无血清培养液诱导。对照组不加任何诱导剂，继续用完 全培养液培养。倒置相差显
18、微镜下观察细胞形态变化。 1 3 免疫组化染色鉴定取诱导5 6 h 后的培养细胞， 用4 多聚甲醛固定3 0 r I l i n ，P B s 洗3 次后，每次2 m i n ，生理 盐水反复冲洗。免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化 酶( N S E ) 、微管联合蛋白一2 ( M A P 一2 ) 、胶质纤维酸性蛋白 ( G F A P ) 的表达。免疫组织化学染色试剂盒( P V 一9 0 0 0P o l y H R Pa n t i m o u s e r a b b i tl g Gd e t e c t i o ns y s t e m ，北京中山 生物技术有限公司) ；抗体：M
19、 A P 一2 ( 小鼠抗大鼠单抗，B D B i o s c i e n c e 8 ) ，N S E ( 小鼠抗大鼠单抗，S j g I I l a ) ，G F A P ( 小鼠多 克隆抗体，S i g I I l a ) 。D A B 显色，光镜下观察。随机计数6 个 非重叠视野( l o o ) ，计算N s E 、M A P 一2 和G F A P 阳性细 胞占总细胞数的比例，结果用均数标准差( 互s ) 表示。 2 结果 2 1 M s c s 的形态学特点冲出的骨髓细胞接种到培养 瓶后，镜下观察接种细胞，大部分为骨髓中各系造血细胞， 形态多样。培养3 天后，弃去悬浮血细胞后，可
20、见贴壁细 胞，细胞形态以圆形为主，间可见不规则、多角形、有小突起 的贴壁细胞。7 天后更换培养液，悬浮细胞、圆形血细胞明 显减少，少量梭形或纺锤形成纤维样细胞开始出现。传代 培养2 3 代后，细胞形态变得较为一致，细长梭形细胞较 多，也有扁平形带突起的细胞，似成纤维样细胞，细胞可散 在生长，有明显的梭形细胞集落呈克隆样生长。细胞到第 4 代后，基本纯化为成纤维样细胞。细胞呈长梭形，胞界清 楚，胞核饱满居中，呈放射状或旋涡样排列。 2 2 M S C s 神经元诱导后的形态变化M s c s 在诱导前培 芝 养液中，细胞形态变化不大，加入含b F G F 的完全培养液预 审 诱导骨髓间质干细胞2
21、 4h ，细胞形态改变不明显。更换含 璧人参总皂苷诱导液后，M S c s 在3 0 m i n 后，开始发生形态变 ： 亿，扁平、梭形细胞胞浆回缩。向核集中，形成一个呈水滴样 1 2 5 8 的细胞体，并可见小的突起从细胞膜向外伸出。诱导3h _ 后，细胞的突起伸长，圆形胞体折光增强，可出现其它的突 刊 起，部分相邻细胞的突起连接成网。诱导5 6 h 后，大部分 呈现神经元样细胞的形态。诱导后的细胞存活约5 天后细 胞逐渐脱落死亡。对照组细胞呈长梭形，形态无上述明显 变化。 2 3 M s c s 神经诱分化后免疫组织化学鉴定人参皂苷 诱导M s C s 转变为类似于神经元的形态，经免疫组织
22、化学 鉴定，诱导5 6 h 后，多数细胞表现为N s E 和M A P 一2 染色 阳性，在胞质中有棕黄色的物质，且有少数细胞c F A P 染色 为阳性。N s E 、M A P 一2 和G F A P 阳性细胞数分别为( 7 6 4 7 ) ，( 6 1 5 2 ) ，( 1 0 2 4 ) 。对照组上述染色均 呈阴性。 3讨论 骨髓是胚胎时期最后一个造血器官，由造血组织和基 质构成，已证实在基质中具有多向分化潜能的间质干细 胞旧o 。在适当的诱导条件下，M s C s 在体外能向内脏中胚 层，神经外胚层和内胚层来源的细胞分化，在体内能分化为 除生殖细胞以外的所有体细胞p 1 。近年来发现
23、M s c s 具有 向神经细胞分化的潜能，如G u e v 鹧等1 动物实验证明， M S c s 可促进脊髓损伤及脑出血损伤的神经修复；w 0 0 d b u r y 等p 1 用D 一巯基乙醇( B M E ) 、二甲基亚砜( D M s 0 ) 和丁羟 基茴香醚( B H A ) 等一些具有还原性的物质成功诱导M s c s 转变为神经元，并表达神经元特有的标记物。表明M s c s 能 在体外可分化为神经元。 现用于分离M S C s 的方法有三：密度梯度离心法、流式 细胞仪分离法和贴壁筛选法。应用流式细胞仪分选时因其 要求细胞数较多操作复杂而增加污染机会，现已少用。现 多用密度梯度
24、离心结合贴壁筛选法。作者利用M S c s 贴壁 生长的特性，在M s c s 分离培养过程中，仅用了贴壁筛选法， 经换液、传代来纯化细胞，发现虽在原代培养前几次换液中 可见有悬浮的造血细胞生长，但经几次换液后即可去除，原 代培养末期细胞形态较均一。经过传代可增加2 倍以上，表 明该法分离培养获得的M S c s 在体外有具备良好的分裂增 殖能力。该法操作简单，步骤少，污染机会小，值得推广。目 前，般把c D 孙c D 。、C D 和c D m 阳性等的骨髓间质细胞 认为是M S C s ，但还没有M S C s 特异性标记物。 目前，已有很多研究方法在体外培养扩增M S c s 并诱 导其向
25、神经细胞分化，然而，在分离培养和诱导分化等环节 中，方法不统一。体外诱导M S C s 向神经细胞分化最终的 目的在于应用，但现国内外研究主要以化学制剂氧化剂如 维甲酸、二甲基亚矾、B 一巯基乙醇、甘油“ o 等作为诱导剂， 诱导后的神经元样细胞体外存活时间短，且有些诱导剂有 一定毒性，不能用于人体内。因此，寻找有效而无害的诱导 剂显得十分必要，中药有着来源广、价廉、副作用小等优势， 对干细胞长期生长分化无毒且有利于分化后细胞活体移 植峥。，已越来越受到重视。本研究表明，经b F G F 预诱导 后，加人人参总皂苷诱导5 6 h 后大部分M s c 8 转变为表 达N s E 、M A P 一
26、2 阳性的神经元样细胞，并有轴突和树突出 现，多个神经元之间可形成轴突联系，且小部分细胞表达 G 队P 阳性。b F G F 是一种有效的有丝分裂原和分化抑制 因子，可影响中胚层、神经外胚层的细胞增殖和分化，用含 b F G F 的完全培养液进行预诱导2 4h ，使问质干细胞处于较 佳的增殖状态，而细胞形态无明显改变。用人参总皂苷诱 导骨髓问质干细胞3h 后，胞体逐渐增大并伸出细长突起 似神经元，5 6 h 后，多数细胞表达M A P 一2 和N s E 阳性。 M A P 一2 和N S E 是神经元特异性标志物，N S E 特异性定位 于神经元，M A P 一2 是神经元特异性的生长相关基
27、因。 M A P 一2 对维持微管的结构和功能有重要作用，高分子盈 万方数据 第2 6 卷第6 期 2 O08 年6 月 中华中医药学刊 C H I N E S EA R C H I V E SO FT R A D I T I O N A LC H l N E S EM E D l C l N E V 0 1 2 6N o 6 J u n 2OO8 土人参叶“解毒消痈“ 疗效及作用机制的实验研究 聂建华1 ，阮时空2 ，吴符火2 ，陈群舷1 3 ( 1 江西赣州卫生学校，江西赣州3 4 1 0 0 0 ；2 福建中医学院，福建，福州3 5 0 0 0 3 ； 3 福州市蔬菜研究所，福建福州3
28、5 0 0 0 0 ) 摘要：目的：旨在通过押茵、抗炎实验评价土人参叶“解毒消痈”功效和作用机制。为保健中药野菜土人参 叶的食用提供客观的药效学实验依据，以促其进一步推广应用、种植、研究。方法：从“痈肿疔疮”疾病入手，通过 现察土人参叶体外抗茵实验，对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响，对小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响，以及对大 鼠棉球肉芽肿的影响，撂讨土人参叶“解毒消痈”的功效，并对其作用机制初步评价。结果：高中剂量土人参叶水 煎液能显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀的肿胀度，减少小鼠腹腔皮肤毛细血管通透性，其效果和免疫剂泼尼松无明 显差异；高剂量土人参叶能显著抑制炎症渗出、肉芽组织形成，其效果和免疫抑制剂
29、地塞米松无明显差异。土人 参叶对金黄色葡萄球茵的M l c 7 8 l m m L ；对腐生葡萄球茵的M I C 3 1 2 5 m g m L ；对乙型溶血性链球茵耐药。结 论：土人参叶能存在“解毒消痈”作用，能显著抗炎、抑茵，但对乙型溶血性链球茵耐药，应和其它具有抑制、杀灭 该茵药物协同配伍应用。 关键词：土人参叶；药理学；解毒消痈；抑茵；抗炎；野菜 中图分类号：R 2 8 2 7 文献标识码：A 文章编号：1 6 7 3 7 7 1 7 ( 2 0 0 8 ) 0 6 1 2 5 9 0 3 E x p er m e n t a IS t u d i e sO nt h ec u r a
30、 t i V ee 什e c ta n dpr n c i p I eO ft h eL e a f0 f P a n i c I e dF a m e f I O w e rt Op 陀V e n tb a C t e r i a f u r t h e rg r o w 【ha n dr e d u c ei n f I a m m a t i o n N I EJ i 蚰h 咂1 ，R u A Ns h i 耐，w uF u - h u 0 2 ，c H E NQ u n h 肌g ， M A P 一2 主要分布于成熟神经元内，而低分子量M A P 一2 主要分布于发育的神经元内。G F
31、 A P 是星形胶质细胞的标 志物，在本诱导体系中，出现了少量( 约l O ) 的神经胶质 细胞，原因可能与M s c s 经历多能干细胞、神经干细胞、神 经前体细胞向成熟神经细胞的分化过程有关。因为在体外 培养过程中，神经干细胞会部分分化产生神经胶质细胞。 另外，在不利于神经元生存的体外培养体系中出现神经胶 质细胞，也许具有支持、营养和保护神经元的意义。 人参总皂苷的抗氧化作用可能是其使M S c s 产生定向 诱导分化的主要机制之一。已有研究表明，人参皂苷可 增强神经元抗氧化能力，减轻氧自由基对神经元的损害，并 且在氧自由基对培养的胚胎海马神经元三磷酸腺苷酶和生 长抑素含量影响的研究中，发
32、现人参皂苷可激活体内s O D 或本身就具有s 0 D 样作用。人参皂苷R b l 及R g l 是其作 用于神经系统的主要成分，张均田1 研究表明，一方面R g l 既能提高突触效能的可塑性，又能提高突触结构的可塑性。 另一方面，从体内外两个方面观察了R g l 对神经干细胞增 殖、分化、存活等多项功能的影响，表明R 9 1 具有促进体外 培养的海马神经前体细胞增殖的能力，可以选择性促进缺 血沙土鼠海马齿状回颗粒下区神经前体细胞的增殖，其机 制可能的影响因素包括N M D A 受体，海马区神经元死亡和 脑内局部N 0 浓度等。对人参皂苷R b l 及R g l 单体诱导体 收稿日期：2 0
33、0 8 0 l 1 5 基金项目：福州市科委资助项目( 2 3 一) 作者简介：聂建华( 1 9 7 8 一) 男，山西寿阳人讲师硬士研究生研 究方向：中草药配伍研究及新药开发。 外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞及与复合 成分人参总皂苷进行比较是今后研究的方向之一。此外， 目前M S c s 的跨胚层分化的机制研究处于初步阶段，至于 激活哪些转录因子或基因使它跨胚层分化为某些特定的细 胞至今仍不清楚。而使用中药诱导干细胞定向分化的研究 工作更是才刚刚起步，其诱导机制、诱导后用于动物体内是 否具有神经样细胞的功能等均有待进一步深入研究。 参考文献 1 沈思钰，干振华，傅晓东，等人参皂苷
34、对神经系统作用的研 究现状及分析 J 安徽中医学院学报，2 0 0 4 ，2 3 ( 1 ) ：6 2 6 4 2 】P i t t g 盯M F ，M a c k a yA M ，B e c ks c ，e t 一M uh 1 i n e a g e 严t e n t 湖 0 fa d u l th u m 仰m e 瞬n c h y m a l 武啪c e l I s J s c i e n ，1 9 9 9 ，2 8 4 ( 5 4 1 1 ) ：1 4 3 一1 4 7 3 Y u e h u aJ ，J a I a g i r d 盯B N 。R e i n h a r d tR L
35、 e ta 1 P l u p o t e n c y m e n c h y n l a l0 fs t c mc c l l sd e v e d 蛔na d u l tm 删w J N d - t u r c 2 0 0 2 4 1 8 ( 6 8 9 3 ) ：4 l 一4 9 4 c u 州晒P ，c r c e u e rF ，D u j o 邗yM ，e ta 1 P “p h c r a ln e n e 。咿n e 叫j o nb yb o 删m wg h o r n a jc c l l s J u m lR e 8 2 0 0 2 ，2 4 ( 7 ) ：6 3 4 6
36、3 8 由 5 w o o d b u T yD ，s c h 哪E J ，P r k 叩D J ，da 1 A d u l tr 毗dh u - 华 l mb o n em 嗍s 帆目| lc e l l sd i f ；m n t i 咖i n 幻n e u r s J J = N 即rS c i ，2 0 0 0 ，6 l ( 4 ) ：3 “一3 7 0 磊 6 】胡俊黄秀榕祁明信，等中药诱导干细胞定向分化的研究 进展 J 中草药，2 0 0 6 ，3 7 ( 1 ) ：1 4 7 1 4 9 1 2 5 9 7 章培军。吕永利，赖红，等氧自由基损伤海马神经元及人参 坐 皂苷的保护作用 J 解剖科学进展，2 0 0 0 ，6 ( 3 ) ：2 6 2 6 6 葡 8 张均田人参皂苷R g l 的促智作用机制一对神经可塑性和神 经发生的影响 J 药学学报，2 0 Q 5 4 0 ( 5 ) ：3 8 5 3 8 8 万方数据