人嗜碱性粒细胞在不同刺激物作用下的组胺释放能力.pdf

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1、论著文章编号： 1007 -8738 （2005） 04 -0519 -03 人嗜碱性粒细胞在不同刺激物作用下的组胺释放能力 朱 薇1，何韶衡1*，林梓霞2，傅意玲1 （1汕头大学医学院变态反应学与炎症学研究所， 2汕头市中心医院麻醉科，广东 汕头 515031 = ） 收稿日期： 2004 -11 -24； 修回日期： 2005 -03 -28 作者简介：朱 薇 （1978 - ） ，女，江苏镇江人，硕士生. Tel： （0754）8900405；Email：shoahenghe hotmail. com *Corresponding author Histamine release pro

2、perties of human basophils in response to various stimuli ZHU Wei1，HE Shao-heng1*，LIN Zi-xia2，FU Yi-ling1 1Allergy and Inflammation Research Institute，Medical College， Shantou University， 2Department of Anaesthesiology， Shantou Central Hospital，Shantou 515031，China Abstract AIM：To investigate the ef

3、fects of protease activated receptor-2（PAR-2）agonist，heparin and other stimuIi on histamine reIease from human basophiIs. METH- ODS：PeripheraI bIood mononucIear ceIIs（PBMCs）were separated by density gradient centrifugation. The PBMCs were then resuspended in compIete Hank s baIanced saIt soIution（HB

4、SS）and chaIIenged with various stimuIating a- gents.Histamine IeveI in sampIes was determined by ELISA. RESULTS： 10 mg/ L trypsin couId induce histamine reIease from basophiIs. However，its stimuIatory effect on basophiIs was weaker than that of anti-IgE，caIcium iono- phore（CI） ，F-Met-Leu-Phe（FMLP） ，

5、C5a and substance P. PAR-2 agonist SLIGKV-NH2faiIed to activate basophiIs. Heparin，C5 and adenosine did not induce any histamine re- Iease at concentrations tested，but heparin enhanced hista- mine reIease induced by C5a and substance P. CONCLU- SION：Trypsin，anti-IgE，CI，FMLP，C5a and substance P can i

6、nduce histamine reIease from baosophiIs，but PAR-2 agonist can not. Heparin can greatIy enhance the abiIity of C5a and substance P to stimuIate histamine reIease，which may be a noveI mechanism of ampIification of basophiI acti- vation signaI. Keywords protease activated receptor-2；basophiI；hep- arin；

7、histamine 摘 要 目的：研究蛋白酶激活受体-2 （PAR-2） 激动剂和肝 素等，对嗜碱性粒细胞组胺释放的影响。方法：用 Ficoll 进行 密度梯度离心分离外周血单个核细胞 （PBMC） 。经 Hank s 平 衡盐溶液 （HBSS） 重新悬浮后进行嗜碱性粒细胞激发实验，用 酶联免疫试剂盒来检测组胺的水平。结果：浓度为 10 mg/ L 胰蛋白酶可引起嗜碱性粒细胞释放组胺，其作用强度较抗 IgE 抗体、钙离子载体 （CI） 及 P 物质等为弱。PAR-2 特异性 激动肽 SLIGKV-NH2对嗜碱性粒细胞没有明显的激活作用， 但抗 IgE 抗体、CI、F-Met-Leu-Phe （

8、FMLP） 、C5a 及 P 物质可 引起嗜碱性粒细胞显著的组胺释放。肝素、C5 和腺苷在试验 浓度内未引起组胺释放，但肝素可显著增加 C5a 和 P 物质诱 导的组胺释放。结论：胰蛋白酶、抗 IgE 抗体、CI、FMLP、 C5a 及 P 物质均可诱导嗜碱性粒细胞显著地释放组胺。PAR- 2 激动肽 SLIGKV-NH2不能引起组胺释放，肝素可增加 P 物 质和 C5a 引起的组胺释放，具有放大嗜碱性粒细胞激活信号 的作用。 关键词 蛋白酶激活受体-2；嗜碱性粒细胞；肝素；组织胺 中图分类号 R392. 12 文献标识码 A 嗜碱性粒细胞和肥大细胞在变态反应中起着初 级效应细胞的作用，其被激

9、活后可释放组胺及细胞 因子等多种炎症介质参与变态反应的发生和发展， 因而其激活和稳定机制一直受到人们的关注 1。He 等 2， 3发现蛋白酶激活受体-2 （PAR-2） 参与了肥大细 胞的活化，以及其被激活后分泌的类胰蛋白酶通过 再激活其细胞膜上的 PAR-2 形成细胞激活的自我放 大机制。同时还对肝素在肥大细胞激活中的调节作 用进行了研究 4。嗜碱性粒细胞与肥大细胞在形态 与功能上有着诸多类似，但关于嗜碱性粒细胞上 PAR-2 的研究以及肝素对肥大细胞激活的调节作用 尚未见报道。最近，我们采用一种可靠的人外周血 细胞嗜碱性粒细胞体外激发系统，通过应用 PAR-2 的激动剂胰蛋白酶、PAR-2

10、 特异性激动肽 SLIGKV- NH2，以及近年来报道的几种能引起嗜碱性粒细胞脱 颗粒的物质与肝素联合应用，对健康人外周血中的 嗜碱性粒细胞进行激发，并通过测定多种刺激剂作 用下净组胺释放率探讨了嗜碱性粒细胞的激活特征。 1 材料和方法 1.1 材料 Ficoll 购自 Amersham 公司。磷酸盐缓冲 液 （PBS） 、牛血清白蛋白、胎牛血清及 Hank s 平衡 盐溶液 （Hank s balanced salt solution，HBSS） 购自 Gibco 公司。钙离子载体 （CI） 、山羊抗人 IgE 抗体、 C5、C5a、P 物质、胰蛋白酶、F-Met-Leu-Phe （FMLP

11、） 915ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2005， 21 （4） 及腺苷和肝素，均为 Sigma 公司产品。PAR-2 激动肽 SLIGKV-NH2和反 PAR-2 激动肽 VKGILS-NH2，由西 安美联公司合成。组胺酶联免疫试剂盒购自 Beck- man Coulter 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 分离纯化人外周血嗜碱性粒细胞 将100 mL 抗凝健康人的外周血用等体积的 PBS 稀释后，用注 射器缓慢抽取并注入装有 Ficoll 的离心管中；两者的 体积比为 2: 1。于 20 以 500 g 无制动

12、、匀速离心 30 min，吸出单核细胞、淋巴细胞层即为 PBMC，用 含 20 mL/ L 胎牛血清的 HBSS 调至 50 mL，混匀以 2 000 r/ min 离心6 min，重复两次。冲洗后的细胞重 新悬浮于 10 mL HBSS 中，待激发用。 1. 2. 2 PBMC 中嗜碱性粒细胞和其他白细胞的鉴定 嗜碱性粒细胞的染色参考肥大细胞染色方法 5， 取10 L PBMC 悬液与20 L 阿辛蓝染料混合，于室 温下染色 20 min 后计数。着色的嗜碱性粒细胞镜下 呈天蓝色。同时取 PBMC 悬液 10 L 经细胞离心制 片后采用刘氏染色并进行细胞分类计数 6。 1. 2. 3 外周血

13、嗜碱性粒细胞的激发实验 详细方法 参考肥大细胞的激发实验 7。在冰上依照实验目的 加相应的试剂于各激发管中。将分离好的嗜碱性粒 细胞于 37水浴箱中预培养 5 min 后，向各个激发 管中加入 100 L 的细胞悬液，再于 37水浴箱中反 应 20 min。在冰上向每管中加入 150 L 冷的 HBSS 终止反应后于 4，以 2 000 r/ min 离心 10 min。取 上清转移至 1. 5 L 的管中，置 -20冻存。组胺的 总释放量是将试管中的细胞悬液煮沸 6 min，于冰上 降温离心后取其上清而获得。以相同的实验方案重 复 5 次，每个样品测定 2 次取其均值。 1. 2. 4 组胺

14、释放率的测定 采用酶联免疫试剂盒进 行检测。100 L 的标准品、对照品 （标准品和对照品 为该试剂盒附带） 或样品 （即实验所得上清） 与 50 L 的乙酰化溶液混匀后，取 50 L 乙酰化后的标准品、 对照品或标本，加入到已包被组胺抗体的 96 孔板 内，再于每孔内加入 200 L 碱性磷酸酶标物室温条 件下培养 2 h。洗板后加 200 L 底物液显色，然后 用酶标仪于波长 405 nm 测定吸光度 （A） 值。组胺的 释放以净释放率表示： 组胺的净释放率 = （组胺的释放量 - 自发组胺释放量） / 总组胺释放量100%。 1. 2. 5 统计学分析 全部结果均采用 SPSS （11.

15、 0 版） 软件分析。数据以 x s 表示。组间数据的比较 采用 t 检验，P 0. 05 者即具有显著性差异。 2 结果 2. 1 PBMC 中白细胞的种类及其比例 按血细胞形 态学标准分类计数，PBMC 中主要有淋巴细胞、单核 细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和少量嗜酸性粒细 胞等，分别占 （62. 5 7. 1） %、 （25. 0 4. 9） %、 （7. 6 3. 1） %、 （3. 8 1. 7） %和 （1. 1 0. 8） %。 2. 2 各种刺激剂对组胺释放的诱导作用 浓度为 0.1 mg/ L 和 1. 0 mg/ L 的胰蛋白酶没有激活嗜碱性 粒细胞的作用，当将胰蛋白酶的浓

16、度增加到 10 mg/ L 时，可引起嗜碱性粒细胞中 8. 6% 的净组胺释放。 PAR-2 的特异性激动肽 SLIGKV-NH2和反肽 VKGILS- NH2对嗜碱性粒细胞均没有明显的激活作用。浓度 为 1: 100 的抗 IgE 抗体、 1. 0 mmol/ L 的 CI、FMLP 和 C5a，可分别引起嗜碱性粒细胞中组胺的净释放率为 10. 9%、 21. 3%、 19. 6%和 20. 3%。P 物质诱导嗜碱 性粒细胞组胺释放的作用较强，浓度为 10 mmol/ L 的 P 物质即可引起 20. 0% 的净组胺释放，而 100 mmol/ L 的 P 物质可引起 53. 7% 的净组胺

17、释放。C5 和腺苷对嗜碱性粒细胞没有明显的激活作用 （表 1） 。 此外， （1 100）mg/ L 的肝素不能引起显著的嗜碱 性粒细胞组胺释放，但可诱导 C5a 和 P 物质增加释 放组胺；而对抗 IgE 抗体、CI、FMLP 及胰蛋白酶诱 导组胺的释放则无明显影响 （图 1） 。 表 1 各种刺激剂对嗜碱性粒细胞释放组胺的影响 Tab 1 Effects of various stimulators on histamine release from ba- sophils（x s） StimulatorNet histamine release rate （%） Trypsin （mg/

18、 L） 0. 10. 2 0. 2 1. 00. 9 0. 6 10. 08. 6 3. 6a SLIGKV-NH2（mmol/ L） 0. 11. 6 0. 7 1. 02. 2 1. 1 10. 00. 7 0. 5 100. 02. 9 0. 8 VKGILS-NH2（mmol/ L） 0. 13. 0 0. 3 1. 00. 8 0. 6 10. 02. 3 1. 0 100. 01. 0 0. 8 Anti-IgE antibody 1: 10000. 4 0. 2 1: 3002. 3 1. 5 1: 10010. 9 1. 6a CI（mmol/ L） 0. 11. 6 1. 1

19、 0. 32. 2 0. 7 1. 021. 3 6. 8a FMLP（mmol/ L） 0. 012. 8 1. 1 0. 108. 0 4. 4a 1. 0019. 6 4. 5a Substance P（mmol/ L） 0. 10. 2 0. 1 025ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2005， 21 （4） 1.01.2 0.4 10.020.0 2.6a 100.053.7 13.1a C5a（mmol/ L） 0.010.1 0.1 0.032.1 1.0 0.1020.3 3.4a C5（mmol/ L）

20、0.010.1 0.1 0.030.8 0.6 0.100.5 0.4 Adenosine（mmol/ L） 0.010.3 0.3 0.100.8 0.5 1.002.8 2.2 10.000.7 0.6 aP 0. 05 vs other stimulator groups. 图 1 肝素对 8 种刺激剂刺激嗜碱性粒细胞组胺释放的影响 Fig 1 Effects of heparin on histamine release from basophils A1，A2，A3： 1，10，100 mg/ L heparin. B1：1 mg/ L trypsin；B2：1 mg/ L tryp

21、sin +10 mg/ L heparin. C1： 10 mmol/ L SLIGKV-NH2；C2： 10 mmol/ L SLIGKV-NH2+ 10 mg/ L heparin. D1：1 : 100 anti-IgE antibody；D2： 1: 100 anti-IgE antibody + 10 mg/ L heparin.E1：1 mmol/ L CI；E2： 1 mmol/ L CI + 10 mg/ L heparin. F1：1 mmol/ L FMLP；F2：1 mmol/ L FMLP +10 mg/ L heparin. G1：10 mmol/ L Substan

22、ce P；G2： 10 mmol/ L Substance P +10 mg/ L heparin. H1： 0.03 mmol/ L C5a；H2： 0.03 mmol/ L C5a +10 mg/ L heparin aP 0.05，compared with the the sum of histamine release induced by the corresponding mediator alone. 3 讨论 本研究结果显示，当胰蛋白酶浓度达到 10 mg/ L 时，能够诱导嗜碱性粒细胞释放组胺，但其作用强度 弱于抗 IgE 抗体和 CI 等阳性对照。不同浓度的 PAR- 2

23、 特异性激动肽均未能激活嗜碱性粒细胞，提示嗜碱 性粒细胞上可能不存在 PAR-2 受体，胰蛋白酶是通 过其他途径或方式激活嗜碱性粒细胞的，这一点与 先前对肥大细胞的一些相应研究明显不同 2， 3， 8。 PAR-2 是 PAR 家族的成员之一，胰蛋白酶、类胰蛋 白酶和 PAR-2 特异性激动肽能够活化 PAR-2。活化 的 PAR-2 能够刺激人呼吸道上皮细胞释放 IL-6 和 IL-8，PAR-2 特异性激动肽能够增加肺上皮细胞 A549 释放粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF） 和嗜酸性粒细胞趋化因子 （eotaxin） 9，提示 PAR-2 在变态反应与炎症中可能起着重要的作用。

24、由于 PAR-2 激动肽不能激活嗜碱性粒细胞表明了嗜碱性 粒细胞与肥大细胞间存在着结构和功能的差异。 本实验结果还显示，肝素对嗜碱性粒细胞的激 活具有调节作用，能显著增加 P 物质和 C5a 刺激释 放组胺。这与 He 等 4已发现的肝素能调节肥大细 胞的激活相一致，说明肝素从这两种细胞分泌后，可 进一步调节肥大细胞和嗜碱性粒细胞的功能。肝素 对抗 IgE 抗体和胰蛋白酶诱导的组胺释放无调节作 用提示，嗜碱性粒细胞与肥大细胞的激活和调节机 制不同。Chaen 等 10曾报道过敏性鼻炎患者血浆中 的 P 物质和血管活性肠肽 （VIP） 的水平比健康对照 明显升高，亦提示这两种因子与导致机体过敏有

25、关。 肝素能增加 P 物质和 C5a 刺激组胺释放的结果提示， 一定浓度的 P 物质激活嗜碱性粒细胞后，该细胞释 放的肝素又可增加 P 物质刺激释放组胺的作用，加 重变态反应的程度。此外，补体系统激活后产生的 C5a 也有类似的作用。 参考文献： 1Wedemeyer J，Tsai M，Galli SJ. Roles of mast cells and basophils in innate and acquired immunity J . Curr Opin Immunol，2000，12 （6） ： 624 -631. 2He S， Gaca MD， Walls AF， et al. A

26、 role for tryptase in the activation of human mast cells： modulation of histamine release by tryptase and inhibi- tors of tryptase J . J Pharmacol Exp Ther， 1998， 286 （1） ： 289 -297. 3谢 华，何韶衡. 特异性类胰蛋白酶抑制剂双苯甲脒对肥大细胞 分泌作用的调控作用 J . 细胞与分子免疫学杂志，2003，19 （1） ： 100 -102. 4He S，Aslam A，Gaca MD，et al. Inhibito

27、rs of tryptase as mast cell- stabilizing agents in the human airways：effects of tryptase and other agonists of proteinase-activated receptor 2 on histamine release J . J Pharmacol Exp Ther， 2004， 309 （1） ： 119 -126. 5何韶衡， 谢 华. 支气管肺泡灌洗液中肥大细胞的染色与激活特点 和组胺测定 J . 汕头大学医学院院报， 2002， 15 （3） ： 129 -130. 6Chen

28、 YC， Wang SY. Activation of terminally differentiated human mono- cytes/ macrophages by dengue virus：productive infection，hierarchical production of innate cytokines and chemokines， and the synergistic effect of lipopolysaccharide J . J Virol， 2002， 76 （19） ： 9877 -9887. 7He S， Gaca MD， McEuen AR， e

29、t al. Inhibitors of chymase as mast cell- stabilizing agents： contribution of chymase in the activation of human mast cells J . J Pharmacol Exp Ther， 1999， 291 （2） ： 517 -523. 8He SH，He YS，Xie H. Activation of human colon mast cells through proteinase activated receptor-2 J . World J Gastroenterol，2

30、004，10 （3） ： 327 -331. 9Sun G，Stacey MA，Schmidt M，et al. Interaction of mite allergens Der p3 and Der p9 with protease-activated receptor-2 expressed by lung epithelial cells J . J Immunol， 2001， 167 （2） ： 1014 -1021. 10Chaen T， Watanabe N， Mogi G， et al. Substance P and vasoactive in- testinal peptide in nasal secretions and plasma from patients with nasal allergy J . Ann Otol Rhinol Laryngol， 1993， 102 （1） ： 16 -21. 125ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2005， 21 （4）