人巨细胞病毒耐药性研究进展.pdf

《人巨细胞病毒耐药性研究进展.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人巨细胞病毒耐药性研究进展.pdf（2页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、浙江临床探学2 0 0 8 年2 月第 t o 卷第 2 期2 5 9 . 人巨细胞病毒耐药性研究进展 高文波翁国斌 人巨细胞病毒( C M V ) 是导致免疫缺陷患者发病和死亡 的一种重要的病毒; 该病毒感染能引起肺部、 胃肠道感染、 视网膜炎等疾病， 并可能与移植受者发生的急、 慢性排斥反 应有关: 通过产生一系列细胞因子、 化学因子和生长因子共 同作用于移植物， 导致移植物功能丧失。当前能治疗该病 毒的药物很少. 主要有核昔拟似物更昔洛韦、 核昔酸拟似物 西多 福韦和 焦磷酸盐拟似物 麟甲 酸钠 I ) 。目 前 对C M V 感染 的 治 疗方案 z 1 : ( 1 ) 标准治疗: 当

2、C M V 感染活动并出现相应 的症状和体征时进行治疗; ( 2 ) 预防性治疗: 在发现 C M V感 染之前即给予预防性治疗措施; ( 3 ) 先占性治疗: 定期监测 C M V 活动性感染， 并在症状发生之前给予治疗; ( 4 ) 延期治 疗: 在早期进行重点监测， 发现活动性 C M V 感染后延长其治 疗时间， 并减少免疫抑制剂。自从 1 9 8 6 年分离到第一例耐 更昔洛韦的C M V 病毒株后， 随着抗病毒药物的使用增加、 较 低的药物浓度以及患者体内高病毒负荷状况， 耐药病毒株 的数量也逐渐增多。C M V 耐药性的出现是患者疾病进展和 治疗失败的一个重要因素， 因此这一问题

3、受到了临床广泛 的关注。 1 流行病学 目前C M V 耐药株的报道针对获得性免疫功能丧失综合 征( A I D S ) 患者的较多， 但由于高活性的抗逆转录病毒治疗 ( H A A R T ) 能有效地诱导C 氏+ T 细胞数量增加， 而使C M V 感 染降低， 其结果是在人体免疫缺陷病毒一1 ( H N一1 ) 型病毒 感染的患者中， C M V 耐药株有所下降3 1 ， 在移植受者中进行 C M V耐药株的估计比较困难。S e a t t l e 报道: 1 9 9 6 一1 9 9 7 年的 2 4 0 例患者， 其中有 1 0 8 例肝脏移植、 1 0 1 例肾移植、 3 1 例胰

4、 肾联合移植， 所有患者均接受更昔洛韦预防治疗， 在5 例患 者中出现C M V 耐药株， C le v e l a n d 报道: 1 9 9 1) 一 2 0 0 1 年的2 2 8 例肺移植、 7 9 0 例心脏移植, 4 9 5 例肝脏移植和8 3 2 例肾移 植， 其耐药性的发生率为1 1 / 2 3 4 5 . C h ic a g o 的研究: 1 9 9 4 - 2 0 0 1 年的9 9 例肺移植, 3 8 例心脏移植、 1 8 例肝移植和4 5 例 肾移植， 这些患者均接受更昔洛 仁 预防治疗， 1 9 例出现耐药 株 。 P a v ia 的 研究 5 1 : 包 括7

5、2 1 例 心脏 移 植、 2 1 0 例肺移 植 患者， 1 9 8 5 一 1 9 9 () 年， 患者只是在出现C M V相关的临床症状 后才进行治疗, 1 9 9 ( 年后， 所有患者均预先进行检测， 并进 行先占 性治疗， 结果只有 1 例出现 C M V 耐药株。这些资料 表明， 实体器官移植中， C M V耐药性变化很大， 从0 . 1 %一 2 . 0 % 至1 0 % 不等( 见表1 ) ; 先占性治疗可能会降低耐药性 的 产 生。 b i t.-等 W 研究发 现， 耐药C M V 感染在 肺移植 患 者中占5 . 2 %， 他们认为这个数值可能由于预后性研究而有 所低估。

6、 2 0 0 4 年有人报道耐药性 C M V 感染占肺移植患者 的1 0 % 7 1 。 新型 免疫抑制的 应用能更好 地控制移植器官的 排斥反应， 但同时也增加了C M V 再激活的机会， 而可能使实 体器官移植中C M V耐药株的数量增多。 表I 近年大型队列研究中C M V 耐药株的发生率( %) 研究者器官移植例数 耐约病毒株例数 D+/ H- D+/ R+ 发生率 1046001097 20900 510181 卜 a nl P Cl e v e la n d aa e a 笋 P a v i a 总计3 4 ( 9 4 . 4 ) 2 ( 5 . 5 ) 翎翻溯9313716 作

7、者单位: 3 1 5 1 0 0 浙江省宁波市泌尿肾病医院肾移植科 注: D / R : 供者/ 受者关系。 2 相关的临床、 病毒学特点 在前高活性抗逆转录病毒时代， C M V是A I D S 患者中的 主要机会性病原体。C M V 感染最常见于血液中C D 4 十 T 细 胞数量低于 1 0 0 / r ru 矛时， 其发病率、 病死率均增加; 外周血 中C M V 的出现是播散性C M V 感染的标志 8 1 ， 其临床症状的 严重程度与血液中C M V 病毒的负荷量有相关性。当时一般 是在出现 C M V 相关症状后才开始应用药物进行治疗， 只能 在一段有限的时间内抑制C M V 水

8、平， 在未经治疗的情况下， 一定会出现 C M V 感染的发生， 当时经常在杭 C M V治疗数周 或数月后出现耐药株。在实质器官移植的研究中， 应用了 预防性治疗和先占性治疗方案， 有超过 9 4 %的耐药株出现 在D + / R 一 ( 供者 C M V血清学阳性/ 受者阴性) 的器官移植 中， 而且， 肺和胰腺移植的受者出现耐药株变异的可能性较 大。目 前普遍认为， C M V耐药的危险因素有接受C M V血清 阳 性供者的器官( D+ / R-) 、 长期口服更昔洛韦( 3个 月) 、 高病毒含量 ( 1 0 , 拷贝/ L ) 、 高效免疫抑制剂应用 等1 9 1 . C M V 耐

9、药多发生在D + / R 一 的患者中。有研究表 明， 肺移植 . 年后， D + / R一 的患者( 2 7 %) 比单纯 D- / R+ ( 3 %) 患者出 现C M V 耐药更为普遍 7 1 。 对于D + / R 一 的患 者， 移植后 1 2 个月出现耐药的概率: 肝移植为0 ， 肾移植为 1 %， 肾/ 胰腺移植为 2 1 %， 而肺移植为 4 0 %。所以， 对于 D + / R 一 患者应该进行有效的预防性或先占 性治疗， 即使对 血液中c w 病毒负荷较轻的患者， 也应该将病毒清除， 以防 止耐药病毒株的出现。临床上发现肺移植患者更易出现 C M V 感染或疾病， 而且机体

10、的高病毒含量似乎更易使更昔 洛韦治疗中出现耐药的 C M V ， 故推测肺移植患者耐药性高 发的原因与其高水平的病毒含量有关; 同时还发现在肺移 植患者中， 耐药 C M V的出现较其他实体器官移植中出现的 时间早( 平均4 . 4 个月: 1 0 个月) ， 以更昔洛韦进行治疗的时 间 短( 平 均1 0 0 d : 1 9 6 d ) lo 7 0 3 耐药性的靶点和机制 C M V D N A多聚酶是当前治疗 C M V 感染的抗病毒药物 的 特异性靶点 I I I ; 此类药物针对的都是病毒编码D N A多聚 酶的复制功能， 临床常用的抗 C M V 感染药物主要有更昔洛 韦、 西多福

11、韦和麟甲酸钠， 其中最常用的是更昔洛韦; 麟甲 万方数据 2 6 0 .浙江临床医学2 0 0 8 年2 月第 1 0 卷第2 期 酸钠常用于更昔洛韦无效的情况下。西多福韦主要用于治 疗A I D S 患者的视网膜炎， 阿昔洛韦及其前体v a la c y c lo v ir 用 于预防疤疹病毒。耐药性的突变通常出现于长期使用抗病 毒药物的情况下， 其原因认为很可能是因为病毒 D N A多聚 酶的校正读码功能极大地降低核昔酸的错参率。耐更昔洛 韦病毒株最常发生 的突变位点 是磷酸转 移酶基因 M97) 12 1 ， 在 该 处出 现的 突 变 抑 制r 药物的 合成 代谢， 降 低 了更昔洛韦

12、的磷酸化作用， 因而抑制其转化成有活性的细 胞内三磷酸盐复合物。编码 D N A多聚酶的基因为U L 5 4 序 列， 同U L 9 7 序列不同， U L 5 4 基因发生突变后可能导致对更 昔洛韦、 麟甲酸钠都产生耐药。U L 5 4 序列较为复杂， 包括 I 一 V i l a 一 r e g io n C 和A 等几部分疤疹病毒科的高度保守区和 间隔区。目 前发现和证实的 U L 5 4 耐药相关突变都位于高 度保守区， 主要有 N 4 0 8 D , F 4 1 2 C , K 5 1 3 E , D 5 8 8 E等。通过重 组病毒的 研究已得到结论， 突变若位于W区和a 一 re

13、 g io n C ( U 1 5 4 序列N 末端) 及V区( U L 5 4 序列 C 末端) 则导致对更 昔洛韦和西多福韦耐药， 若位于II区和W区( U L 5 4 中间) 则 对磷甲酸钠耐药。对西多福韦和麟甲酸钠耐药性的突变只 出现于U L 5 4 基因上 13 1 0目 前， 对U L 5 4 基因耐药性突变的 研究已 取得了 很大的进展， 其中最主要的是对点突变的研 _ 究， 其耐药性突变可发生于密码子3 0 0 至 1 0 0 ) 之间的一段 巨大的区域中。M c h r d a d等L 14 J 发现在 U L 5 4的保守区 1 4 1 9 M , Q 5 7 8 H 和L

14、 7 7 3 V 中有3 个新的突变， 导致对磷甲 酸钠 的耐受， 而不产生对更昔洛韦的耐受性。总之， 对更昔洛韦 的耐药性来自于 U L 9 7 , U L 5 4 或两者的突变， 而对西多福韦 和麟甲酸钠耐药性的突变只见于 U L 5 4 。进一步分析发现， U L 5 4 中对更昔洛韦耐药性的突变能对西多福韦产生交叉耐 药性， 这种耐药性的主要原因是长期使用更昔洛韦造成的。 4 耐药性的检测 对耐药C M V 病毒株耐药性的检测分为表型和基因型两 种方法。表型的检测方法是检测细胞培养基中的病毒复 制， 根据药物的浓度和病毒的生长状况来计算 I C 5 0 ， 进而把 病毒分为敏感型和耐药

15、型。该方法的周期很长， 因为病毒 生长慢， 并需要活的病毒。C M V耐药性检测的“ 金标准” 是 空斑降 解检测方 法 川， 该方法是在药物存在的 情况下， 通过 测定受感染的斑块而进行的， 实验步骤包括病毒的分离培 养、 传代培养和扩增、 量的滴定、 耐药浓度的测定， 完成整个 实验需要1 个月以上的时间， 而且在传代培养中可能出现 另外的耐药株， 因而限制了该方法的广泛应用。目 前已开 发出采用流式细胞仪、 放射探针、 酶联免疫吸附试验 ( E L L S A ) 等检测方法， 以缩短检测时间， 这些方法都需要活 的病毒株， 并在分析过程中， 还应有标准的耐药株和敏感株 作对照， 也限制

16、了临床应用 16 1 。基因型检测是建立在C N N 基因组中耐药性突变的基础上， 耐更昔洛韦的 C M V株主要 是 U L 9 7 基因的突变， 这些突变集中于密码子4 6 0 , 5 2 0 和5 9 0 - 6 0 7 ， 因而可以用P C R加酶切的方法来检测。密码子4 6 0 和5 9 4 的突变导致内切酶位点的消失， 而密码子 5 2 0和 5 9 5 的突变导致内切酶位点的增加， 通过电泳生成不同的内切 酶图谱， 只要突变的病毒株达到所有病毒株的1 0 %， 即可检 测得到。这种限制性酶内切方法最大的优点是操作简便、 快捷， 在2 d 内即可得到结果， 并且可适用于多种临床标本

17、 ( 血浆、 脑脊液等) ， 缺点是不能发现不导致限制性内切酶图 发生改变的突变， 例如少数突变只发生于 U L 5 4 序列， 不存 在于U L 9 7 序列。所以限制性内切酶图阳性的标本可以肯 定是对更昔洛韦耐药， 而对于阴性的标本不能完全肯定绝 对不耐药， 有时需要做进一步的测序工作。目前, P C R加限 制酶切的方法不仅限于检测U 1 9 7 的突变， 也可以用来检测 U L 5 4 序列中的L 5 0 1 F 和A 8 0 9 V 基因。由于基因测序技术已 取得了很大的进展， 用 P C R加酶切或 D N A核昔酸测序以检 测病毒株发生的基因突变， 是当前的最佳检测手段。总之，

18、对 C N N耐药性的研究表明， 长期使用抗病毒药物导致了耐 药株的产生， 其交叉耐药性和与药物相关的毒性作用限制 了药物的治疗效果， 因而当前急需研究新的作用机制， 研制 新的抗 C N N药物。 参考文献 1 M e h n la d M , I u t t ie S W. I a w r e n c e D , e t a l . V a r i a t i o n s i n th e c y - t o n ae g a lo v ir u s D N A p o l y m e r a s e a n d p h o s p h o t r a n s fe r a s e g e

19、 n t-4 i n re la t io n to f o s c a rn e t a n d g a n c ic l o v i r s e n s i ti v i t y . J o u rn a l o f C li n i c a l V ir o lo g y , 2 0 0 1 , 2 3 ( l ) : 1 一1 5 . 2 B o u c h e r A , L a d H , C o ll e j t e S , e t a l . C y to m e g a lo v in a s i n f e c t i o n i n k id n e y tr a n s

20、 p la n t r e c ip ie n ts : e v o l u t i o n o f a p p r o a c h t h r o u g h t h re e 、 . T r a n s p l a n t P r o c e e d i n g s , 2 0 0 6 , 3 8 ( 1 0 ) : 3 5 0 6 一 3 5 0 8 . 3 J a b s D , M a rt i n B , F o r m a n M , e t a l . M u ta ti o n s c o n f e r r i n g g a n c ic l o v ir r e - s

21、 is t a n c e in a c o h o r t o f p a t ie n ts w ith a c q u i r e d im m u n o d e f i c ie n c y s y n d n x n e a n d c y to m e g a l o v ian s r e t in i t i s . J I n f e s t D is , 2 0 0 1 ， 1 8 3 ( 3 ) : 3 3 3 一 3 3 6 . 4 l u r a i n N , B h o r a d e S , P u r s e ll K , e t a l . A n a l

22、y s i s a n d c h a r a c te r iz a t io n of a n t i v i r a l d r u g 一 、s ta n t c y t o m e g a l o v i r u s is o l a te s f r o m s o l id o r g a n t r a n s p la n t r e c i p i e n t s . J I n f e c t D i s , 2 0 0 2 , 1 8 6 ( 6 ) : 7 6 0 7 6 7 . 5 G e m a C , B a ld a n t i F , G r o s s i

23、 P , et a l . D i a g n o s i s a n d m o n i to r i n g o f h u m a n c y to m e g a l o v i r u s i n f et t io n in t r a n s p la n t r e c i p ie n ts . R e v M e d M i c r o b i o l , 2 0 0 1 ， 1 2 ( 2 ) : 1 5 5 一1 6 2 . 6 K r u g e r R M , S h a n n o n W, A r m s M , e t a l . T h e im p a c

24、 t o f g an c ic lo v ir - re - s is ta n t c y to rn e g a l o v ir u s i n f e c t i o n a ft e r l u n g tr a n s p l a n t a t io n . T r a n s 目 an ta t i o n , 1 9 9 9 , 6 8 ( 9 ) : 1 2 7 2 -1 2 7 9 . 7 B r u y n D e , W h e lan T P , M u l l ig a n M S , e t a l . I n v a s i v e P n e a m o

25、c o c c a l h r fe c - Li o n s i n A d u l t L u n g T r a n s p la n t R e c i p i e n ts . A m e r ic a n J o u rn a l o f T r a n s p la n - t a t i o n , 2 0 0 4 , 4 ( 8 ) : 1 3 6 6 一1 3 7 1. 8 C h r is to p h S , E lis a b e th P , T h e re s i a P . C y t o m e g a l o v ir u s d is e a s e i

26、 n th e ， o f h i 训y a c t i v e an t ir e t ro v i r a l th e r a p y ( h 1 A A 1 1 r ) . J o u rn a l o f c li n ic a l V i r u lo - g y , 2 X 1 6 , 3 7 : 1 一 9 . 9 B a l d ant i F , S i m o n c i n i L , S a r a s i n i A, e t a l . G anc i c l o v i r r e s i s t a n c e a s a re - s a lt o f o

27、r a l g a n c ic l o v i r in a h e a r t tr a n s p lant r e c i p i e n t w i th m u l t i讨 e h u m a n cy t o m e g a lo v ir u s s t r a in s i n b l o o d . T r a n s p l a n t a ti o n , 1 9 9 8 , 6 6 ( 3 ) : 3 2 4 - 3 3 0. 1 0 E m e ry V C , S a b i n C A , H a s s a n 一 W a l k e r A F , e t

28、 a l . V ir a l 一 l o a d k i n e t i c s a n d C M V d i s e a s e . L a n c e t , 2 0 0 0 , 3 5 6 : 1 3 5 3 一1 3 5 9 . 1 1 J a b s D , G r if th s P . F o r m iv i rs e n f o r th e tr e a t m e n t o f c y t o m e g a l o v ir u s re - ti n it is . A m J O p h t h a l m o l , 2 0 0 2 , 1 3 3 ( 4

29、) : 5 5 2 一 5 5 8 . 1 2 Z h o u L , F an J , Z h e n g S , e t a l . P r e v a le n ce o f h u m a n c y to rn e g a lo v i n rs U 1 9 7 m u t a t io n in t r a n s p l an t r e c ip ie n ts i n C h i n a . T r a n s p l a n t a t io n P r o c e e d - in gs, 2 0 0 6 , 3 8 ( 8 ) : 2 9 2 6 一 2 9 2 8 .

30、 1 3 C h o u S , L u r a in N , T h o m p s o n K , e t a l . V ir a l D N A p o l y m e r a s e m u t a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h d r u g r e s i s t a n c e in h u m a n c y t o m e g a lo v ir u s . J In f e c t D is , 2 0 0 3 , 1 8 8 0) : 3 2 一 4 0 . 1 4 M e h rd a d M , L o t t i e

31、S , B r i tt a W, e t a l . P o i n t m u t a t i o n s in d u c e d场fo s - c a rn e t ( P F A ) i n t h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s D N A州y m e r a s e . J o u rn a l o f C l i n i c a l V iro lo g y , 2 0 0 3 , 2 6 ( 2 ) : 3 0 1 一 3 0 6 . 1 5 L e n 帅 M , S ta n a t S , B i ro n K , e

32、 t a l . A s t a n d a r d i z e d p l a q u e r e d u ct i o n a s - s a y fo r d et e rm i n a t i o n o f d r u g s u s c e p t i b il i t ie s o f c y to n re g a l o v u v s c li n i c a l i s o l a t e s . A n t ir n i c ro b A g e n t s C h e n r o t h e r , 2 0 0 0 , 4 4 ( 3 ) : 6 8 8 一 6 9 3 1 6 F a u s t o B , N e ll L , G i u s e p p e G . C l i n i c a l a n d b i o l o g ic a s p eA !ts o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s r e s is t a n c e t o a n t i v i r a l d n Jp. H u m a n I n a r u n o lo g y , 2 0 0 4 , 6 5 ( 2 ) : 4 0 3 - 4 0 9. 万方数据