人巨细胞病毒感染对脐血淋巴系祖细胞增殖的影响.pdf

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1、第16卷第2期 中国现代医学杂志 !Vol. 16 No. 2 2006年1月!China Journal of Modern Medicine!Jan. 2006 文章编号:1005-8982(2006)02-0210-04 论著 人巨细胞病毒感染对脐血淋巴系祖 细胞增殖的影响! 刘文君 1,2,金润铭1,李宏颖2,付晓冬2,邓正华2,林 江 2,郭渠莲2 (1.华中科技大学同济医学院附属协和医院 儿科,湖北 武汉430022; 2.泸州医学院附属医院 儿科,四川 泸州646000) 摘要: 目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染对脐血淋巴系祖细胞(CFU-TL)集落增殖能力的影响。 方法 采

2、用甲基纤维素半固体培养CFU-TL集落, 不同浓度HCMV9:;169持续攻击CFU-TL, 观察计数CFU-TL 集落数、抑制率、集落峰值时间及集落维持时间;用MTT法测量HCMV对宿主细胞增殖活性的影响;用流式细 胞仪测定相应表面抗原阳性T-淋巴细胞百分率; 并用聚合酶链反应 ( :;169;?:。结果HCMV感染组CFU-TL 集落数明显低于对照组( ?*/$1/(2 A-3(/t-ComUared XiSh She conSroM JrouUR, She CFU-PL coMonieR in HCMT in! fecSion JrouU decreaRed RiJnificanSMy

3、and XiSh diQerRiSy in aMM She infecSed JrouURNcdVYVaOY IS RuJJeRSed ShaS She RuUUreRRion and She SiSer of QiruR XaR doRe-deUendenSY Phe eeeUinJ Sime o CFU-PL coMonieR inecSinJ HCMT JrouUR XaR RhorSer Shan ShaS o conSroM JrouUR, WuS She ormaSion Sime and She UeaeinJ Sime in each JrouU XaR noS 收稿日期:20

4、05- 03- 31 !基金项目:本课题系四川省教育厅重点项目( 项目编号 199B- 133) G作者简介H 刘文君 现为华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科在职博士研究生 210! 第2期刘文君,等:人巨细胞病毒感染对脐血淋巴系祖细胞增殖的影响 人 群 中 巨 细 胞 病 毒 (human cytomegalovirus, 4567)感染较为普遍,4567感染可导致早期流 产,新生儿死亡,及先天畸形、中枢神经系统损害、血 液系统损害、肝炎、肺炎、视网膜病等各种疾病89:,亦 可能损伤机体的免疫功能,是免疫功能不全者重要 的致病和致死病因82:,测定;淋巴细胞集落产率,对 了解免疫系统功能

5、降低或造血功能障碍疾病患者的 细胞免疫功能是一种有效的方法。 本研究采用造血 祖细胞培养技术,观察4567对脐血淋巴系造血祖 细胞集落形成的影响。 探讨4567感染引起免疫功 能紊乱的原因。 9 ?g,4567 ?g6及4567 CA9DE株购于同济医科大学同济医院, 感染滴度为9FG=H半数组织感染量(;5?AHF) 。 病毒 原 液 经 紫 外 线 照 射IF 6的培养基中,于IZ、饱和 湿度、H52浓度孵箱中培养Z2 h , 离心9F min (2 FFF rTmin) 取上清,过滤除菌,置G保存,即为 P4C ;56。 9=G=I ;Q培养方法按照本室建立的方法 进行8I:,采用甲基纤

6、维素半固体法加以改进。 培养体 系为:单个核细胞悬液(5S65)2a9FH、F=Kb甲基 纤维素、2Fc小牛血清、9dP4C 6,He9F H6 巯 基乙醇、9Ff的P4C ;56。 不同浓度及灭活的病毒 液,适量的RP6?9DGF。 9=G=G细胞亚群测定分别与培养前 和培养Z细胞单克隆抗体(5AIs、5AGt和5AKu) 与之 结合, 用流式细胞仪测定相应表面抗原阳性;淋 巴细胞百分率 9=G=Z 聚合酶链式反应 (P5R)检测集落细胞内 4567 CA9DEABC 收集集落细胞离心弃上清,生 理盐水洗涤2次,以除细胞外残留的病毒。 按P5R 试剂盒说明操作, 提取ABC, 加入引物,hB

7、;P, ;avABC聚合 酶, 扩增反应 , 加入P5R反应 液 different signifficantly. The infected CFU-TL proliferation index after 48 h, 72 h was 1.59, 1.28. The index after 96 h, 120 h was 0.58, 0.32. The colonies consist of CD3+cell. HCMV-AD169DNA in CFU-TL was detected by PCR in nuclear of CFU-TL.*Con lusion+HCMV can inhi

8、bit the differentiation and proliferation of lymphocyte progenitors in vitro, which relates to the damage of CFU-TL after HCMV infection. Key words: human cytomegalovirus; lymphocyte progenitor; cord blood 211! 10L,经琼脂凝胶电泳30 min后,在紫外线灯下观 察结果,产生一条420 bp的DNA片段为阳性。 1.4.8 统计学分析结果用均数加减标准差(!s) 和抑制率表示,进行方差

9、分析,有统计学意义后组间 均数两两比较用SN7法用统计软件S8SS10.0完 成。 抑制率(9):(实验对照组集落数;病毒组集落 数)。 2? 结果 2.1 ABCDL集落组成形态学分析 当集落形成后, 倒置显微镜下用毛细吸管小心 取单个集落置于载片上,用力吹散,用瑞氏染色光镜 下观察, 培养第3天, 集落细胞呈原始淋巴细胞外 观,第E天呈小淋巴细胞外观。 2.2 FGH对ABCDL集落生成的影响 见表1。 与空白对照组和灭活对照组相比,3个 滴度的FGH感染组ABCDL集落产率减少I差异 具有统计学意义JKL0.01M,且抑制程度随FGH浓 度增高抑制越明显。 而空白对照组和灭活对照组之 间

10、差异无统计学意义JNO0.0PM。 表1Q FGHAD1RS的人脐血ABCDL集落的影响 注: !与空白对照组和灭活对照组比较,TL0.01 2.3 ABCDL集落维持时间 培养第2天可見双细胞,第3天出现ABUDL 小集落, 逐渐增大。 结果表明空白及灭活对照组集 落在第E天集落产率达高峰, 集落维持时间在1P V 左右。 而感染组的1W10集落维持时间约E?V,1X 100感染组维持时间约S?V,1Y1?000感染组约11?V (ZL0.0P)。 表明随着FGH感染ABCDL浓度增 高集落维持时间缩短, 呈剂量依赖关系。 而各组集 落出现时间及高峰期无差异。 2.4? ? FGH对宿主细胞

11、增殖活性的影响 从表2可以看出在FGH感染的48?、E2?内 每组细胞的吸光值均明显高于对照组,而FGH感 染的SR和120?内每组细胞的吸光值明显低于对 照组。 差异具有显著性均(L0.01)。110FGH 感染48和E2?宿主细胞增殖指数分别为1.PS和 1.28。 感染SR?、120?的增殖指数分减少别为0.P8 和0.32.。 表明FGH感染后在早期抑制宿主细胞 凋亡,促进细胞增殖;而SR?后可抑制细胞增殖。 2.P? ? ABCDL培养前后D细胞亚群的变化 如表3结果所示D3细胞较培养前明显提高, 占集落组成细胞的(S0.4_P.R),即证明集落组成 细胞中绝大部分细胞为D淋巴细胞。

12、 提示在本实验 中培养出的集落为D淋巴祖细胞。 表2Q Q Q GDD观察FGH对宿主细胞增殖活性的影响 (,!as) 注:“与空白对照组比较差异具有显著性(bL0.01) 表3Q Q培养前后脐血D淋巴细胞亚群(!cs,d) 2.RQ Q集落细胞内的FGHCDNA的检测 FGH感染组提取物扩增后产生一条420Qbp 的DNA片段,FGH为阳性。 而空白对照组和灭活 对照组则未见其扩增带。 3Q Q讨论 FGH感染是小儿中最常见的感染性疾病之 一ePf。 近年本课题组eRhSf已证实FGH感染可致造血 功能紊乱,可抑制红系造血祖细胞(ABCi)、粒C巨 噬 系 祖 细 胞(ABCjG)、多 向

13、造 血 祖 细 胞 (ABCGik)和巨核系祖细胞(ABCG7)分化与增 殖。 国外研究发现GH可以直接或间接抑制所有 造血祖细胞的集落形成, 尤其对淋巴系和巨核系祖 细胞的抑制最显著e10f。 国内未见FGH对淋巴系祖 细胞的影响报道。 本文采用甲基半固体培养方法培养ABCDL, 用不同浓度巨细胞病毒FGHCAD1RS体外感染人脐 血ABCDL,结果显示FGH对脐血ABCDL分化 组别 空白对照组1ES.2PlR.E4 灭活对照组1E8.0PmP.23 1n10FGH10P.E0oE.RS#41.03 1p100FGH12R.S0qE.E1$2S.21 1r1000FGH143.40sS.0

14、S%20.00 A值8R.P1 tutnvQ nwmbxyQ inibizitnQ yzx |210PQ G?|?M 组别“48E2 对照组200.P3R?0.0P0.R0R?0.04 1?10FGH200.E12?0.0P而96 h后可抑制细胞 增殖,诱导细胞凋亡,参与HCMV疾病的病理过程。 表明HCMV_AD169株对脐血CFU_TL分化和增殖有 抑制作用。 其作用机制不明,可能与以下因素有关: 对淋巴系祖细胞的直接感染; 通过感染正常的基质 细胞,从而导致病毒在造血祖细胞的传播,使造血祖 细胞增殖和分化受阻;HCMV诱导CFU_TL的凋 亡;通过免疫细胞介导抑制造血祖细胞。 本文采用P

15、CR检测了集落细胞中的HCMV_ DNA。 结果在各培养体系CMV感染组中均能检测 到HCMV_AD169 DNA,而对照组中均未出现相应阳 性扩增带。结果表明淋巴系祖细胞可能是HCMV宿 主 细 胞 之 一 ,HCMV_AD169株 能 直 接 感 染 脐 血 CFU_TL, 并抑制淋巴系祖细胞的增殖,CFU_TL减 少,导致CD4下降,从而引起细胞免疫功能紊乱,此 与临床上HCMV感染患者出现免疫功能紊乱可能 有关。 1 RAWLINSON W, SCOTT G. Cytomegalovirus. A common virus causing serious diseaseJ. Aust

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