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1、基金项目： 卫生部部属 （管） 医疗机构临床学科重点资助项目 （2001） 作者单位： 北京大学人民医院肝胆外科中心 通讯作者： 冷希圣， E-mail： L 基础研究 人树突状细胞与肝癌细胞系 HLE 融合 细胞的构建 关心彭吉润冷希圣 【摘要】 目的构建人源树突状细胞 （DC） 与肝癌细胞系 HLE 的融合细胞。方法含 15%FCS 的 RPMI 1640 培养 HLE 细胞，用 GM-CSF 和 IL-4 培养成人外周血单核细胞 7 d，并用 TNF-和 PGE2促 成熟 2 d 后获得成熟 DC；用荧光染料 PKH67-GL （绿色荧光） 和 PKH26-GL （红色荧光） 分别标记
2、DC 和 HLE 细胞， 以 50%聚乙二醇和 10%二甲基亚砜为融合剂， 构建可供流式细胞仪快速筛选的融合细胞。 结果成功构建具有红、 绿双色荧光的人源 DC 与 HLE 的融合细胞，融合率为16.8%。结论利用 PKH67-GL 和 PKH26-GL 为标记， 可获得便于快速识别和筛选的 DC 与肝癌细胞的融合细胞， 为使用融 合 DC 疫苗治疗肝癌奠定了基础。 【主题词】 人树突状细胞； 肝癌细胞系 HLE 细胞； 融合细胞 Establishment of dendritomas by fusion of human dendritic cells with human hepatoc
3、ellular carcinoma cell line HLE cellsGUAN Xin，PENG Ji-run，LENG Xi-sheng. Department of Hepatobiliary Surgery，Peking University Peoples Hospital，Beijing 100044，China Corresponding author：LENG Xi-sheng，E-mail： Lengxs2003Myahoo. Nom 【Abstract】 ObjectiveTo construct dendritomas by fusion of human dendri
4、tic cells with HLE cells， a human hepatocellular carcinoma cell line. MethodsHLE cells were cultured in RPMI 1640 with 15% FCS. Human dendritic cells （DCs）were obtained from peripheral blood monocytes cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 for 7 days，matured with TNF-and PGE2for 2 days. The DCs
5、 and HLE cells were labeled with green fluorescence dye PKH67-GL and red fluorescence dye PKH26-GL，respectively，and fused in 50% polyethylene glycol （PEG）+ 10% dimethyl sulfoxide（DMSO）to generate dendritomas for rapid fluorescence-activated cell sorting （FACS） . ResultsDendritomas with dual red-gree
6、n fluorescence were constructed successfully，and FACS analysis showed the effective fusion rate was 16. 8% . ConclusionWith fluorescence dyes PKH67-GL and PKH26-GL as fusion markers，dendritomas for rapid fluorescence-activated cell sorting are constructed，which may throw new light on immunotherapy o
7、f hepatocellular carcinoma. 【Subject words】 Dendritic cell； Hepatocellular carcinoma HLE cells； Dendritoma 树突状细胞 （DC） 作为功能强大的专职抗原呈 递细胞， 在抗肿瘤免疫应答中起着关键作用。1997 年，Gong 等 1 首先用完整的乳腺肿瘤细胞与培养的 DC 融合， 制成融合树突细胞瘤 （dendritoma） ， 并证实 这种融合细胞能有效呈递肿瘤抗原， 诱导出特异性 抗肿瘤免疫应答。为了探讨用人源肝癌细胞系 HLE 和DC 构建融合细胞的可行性， 我们以荧光染料 PKH67-
8、GL 和 PKH26-GL 为标记， 用这两种细胞成功 构建了可用于流式细胞仪快速筛选的融合细胞。 材料与方法 1. 材料： 健康成人外周血由北京市血液中心提 供； 人肝癌细胞系 HLE 购自中国科学院上海细胞生 物学研究所。重组人 IL-4 购自美国 Promega 公司； 重组人 GM-CSF 及 TNF-购自美国 R&D 公司； PGE2、 融合剂 （50%PEG + 10%DMSO） 、 细胞膜荧光标记试 剂盒 PKH67-GL 和 PKH26-GL 均购自美国 Sigma 公 司； 灭活标准胎牛血清 （FCS） 购自美国 Hyclone 公 司； RPMI 1640 培养基购自美国
9、GIBCO 公司； 淋巴细 胞分离液 （Ficoll-Hypaque， 1.077） 购自瑞典 Pharmacia 公司； 培养瓶及培养板均为美国 Costar 公司产品； MACS CD14 正选磁珠购自德国 Miltenyi Biotec 公司； FITC-CD80、 PE-CD86、 PE-CD83 和 HLA-DR-APC 等单 抗购自美国 B. D. 公司； 流式细胞仪 （FACS Calibur） 564中华肿瘤杂志 2005 年 8 月第 27 卷第 8 期Chin J Oncol，August 2005，Vol 27，No.8 为美国 B. D. 公司产品； 激光共聚焦显微镜
10、（TCS. NT） 为德国 Leica 公司产品； 倒置荧光显微镜 （IX70） 为日本 Olympus 公司产品。 2. 人肝癌细胞系 HLE 的培养： 取 1 107液氮 冻存的 HLE 细胞， 复苏后， 加入 5 ml 培养液 （含 15% FCS、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素和 100 g /ml 链霉素的 RPMI 1640） 洗涤、 离心。细胞沉淀 中加入前述培养液重悬， 细胞密度 1 106/ml， 移入 75 ml 培养瓶， 加足培养液，于 37、 5%CO2的孵箱 中培养， 隔日换液。融合前用 0.25%的胰蛋白酶消 化， 获取 HLE 细胞，
11、 用无血清 RPMI 1640 培养液洗 涤， 使成为单细胞悬液。 3. DC 的制备： 用淋巴细胞分离液， 以密度梯度 离心法， 从健康献血员外周血中获得 1 108个单核 细胞。按 MACS 公司提供的操作流程，用 CD14 正 选磁珠分离出 CD14+细胞约1.2 107。PBS 溶液洗 涤后， 加入 DC 完全培养基 （含 RPMI 1640、 10%FCS、 1000 U/ml GM-CSF、 500 U/ml IL-4 和100g /ml 庆大 霉素） ， 调整细胞密度至 5 105/ml， 加入 6 孔培养 板，于 37、 含 5%CO2的孵箱中培养 7 d， 隔日换 液。第 7
12、 天再加入 1000 U/ml TNF-和 1 g/ml PGE2， 继续培养 2 d 促使其成熟。第 10 天收集悬浮 的 DC， 用流式细胞仪检测其 CD80、 CD86、 CD83 和 HLA-DR 分子表达情况， 并用于融合实验。 4. DC 和 HLE 细胞的荧光标记： PKH67-GL 标记 DC， 呈绿色荧光； PKH26-GL 标记 HLE， 为红色荧光。 详细操作步骤按 Sigma 公司提供的说明进行。染色 的效率用倒置荧光显微镜观察评价。 5. DC 和 HLE 细胞的融合：将已经染色的 DC 和 50 Gy 照射过的 HLE 细胞，以 1:1 的比例混合， 1000 r/
13、min 离心 10 min， 去除培养液。用无血清 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次， 离心后弃上清， 吸净残 液， 轻敲管底使细胞呈疏松糊状。于 60 s 内滴入 1 ml 融合剂， 轻轻搅拌细胞悬液； 随后于 6 min 内缓 慢加入 10 ml 无血清的 RPMI 1640 培养液； 最后， 补 加 同样的RPMI1640培养液至40 ml， 以1000 r / min 离心 5 min， 弃上清， 然后用无血清 1640 液再洗涤 1 次。用共聚焦显微镜对融合细胞照相。用流式细 胞仪检测红绿双荧光细胞所占的百分率代表细胞融 合率。 结果 流式细胞仪检测显示， 树突状细胞的 CD8
14、3、 CD80、 CD86 和 HLA-DR 表 达 率 分 别 为 62. 0%、 90.4%、 98.5%和 99. 8% （图 1） 。倒置荧光显微镜 下观察， 荧光染料 PKH67 和 PKH26 将 DC 和 HLE 细 胞分别染上红色与绿色荧光， 其染色率均超过 95%。两种细胞融合后形成的融合细胞在共聚焦显 微镜下呈现红绿双色荧光 （图 2） ， 融合效率为 16.8% （图 3） 。 图 2 激光共聚焦显微镜下所见的融合细胞 图 1 流式细胞仪检测 DC 表面标志 CD83、 CD86、 CD80 和 HLA-DR 的表达情况 讨论 许多研究表明， 将已知的肿瘤抗原或抗原肽负
15、载于 DC， 或通过转基因技术使 DC 表达特异性肿瘤 抗原， 制备的 DC 疫苗能有效激活 T 淋巴细胞的抗 肿瘤免疫应答 2-5 。但由于肿瘤特异性抗原常常不 能明确， 从而限制了上述方法的临床应用。制备 DC 疫苗的另一种策略是用 DC 与肿瘤细胞直接融合， 制 备成融合DC疫苗。 融合DC疫苗能呈递肿瘤细 664中华肿瘤杂志 2005 年 8 月第 27 卷第 8 期Chin J Oncol，August 2005，Vol 27，No.8 a： PKH26 染色的肝癌细胞 HLE；b： PKH67 染色的 DC；c： 融合后的红、 绿双阳细胞；d： DC 与 HLE 细 胞混合的对照组
16、 图 3 流式细胞仪检测的细胞融合效率 胞所有可能的抗原， 而不必明确各个肿瘤特异性抗 原， 即可有效诱导抗肿瘤免疫应答， 因此， 在理论上 融合 DC 疫苗具有优越性 1，5 。目前， 国外已经有报 道将融合 DC 疫苗用于乳腺癌、 恶性黑色素瘤、 肾细 胞癌、 胃癌和神经胶质细胞瘤等多种肿瘤的期临 床免疫治疗试验， 并取得了一定疗效 5-11 。 在免疫治疗中， 为了避免患者遇到未融合的肿 瘤细胞污染，需要对融合细胞进行筛选， 以提高融 合 DC 疫苗的纯度。为此， 我们需要用特异性标记 抗体， 或者用有特异性标志的肿瘤细胞系， 以便于流 式细胞仪筛选融合细胞， 这也限制了此方法在临床 上
17、的应用。因为肿瘤标志是未知的， 而且标记抗体 本身可能会因封闭 DC 的免疫分子 （如 CD86、CD80、 CD40 等） 而对融合细胞的功能产生影响。为解决这 个难题， Holmes 等 12采用人工荧光染料 PKH67-GL 和 PKH26-GL 分别标记 DC 和肿瘤细胞， 并用流式细 胞仪对融合 DC 疫苗进行迅速准确的筛选。有研究 表明， PKH67-GL 和 PKH26-GL 对被标记细胞的活 性、 增殖及功能无显著影响， 对融合过程无明显影 响， 未发现明显的毒副作用 13-15 。我们的研究结果 显示， PKH67-GL 和 PKH26-GL 在极低浓度 （20 nmol/
18、L） 即可有效标记人 DC 和肝癌细胞， 两种细胞染色 后混合培养过夜， 镜下未见红、 绿双色细胞， 且细胞 很少死亡， 说明 PKH67-GL 和 PKH26-GL 染料无明显 的移染性， 在工作浓度范围内对细胞无明显毒性。 共聚焦显微镜下观察显示， 融合细胞呈现明显的红、 绿双色荧光， 其强度可供流式细胞仪进行有效筛选。 我们以 PKH67-GL 和 PKH26-GL 荧光染料为标 记， 成功构建了便于识别和筛选的人源 DC 与肝癌 细胞的融合 DC 疫苗， 这种人工染色方法快速而简 便， 无需考虑肿瘤细胞的抗原标志就可构建用于流 式细胞仪快速筛选的融合细胞， 这为临床应用融合 DC 疫苗
19、治疗肝癌提供了一个简便、 快速的方法。 参考文献 1 Gong J，Chen D，Kashiwaba M，et al. Induction of antitumor activity by immunization with fusions of dendritic and carcinoma cells. Nat Med， 1997，3：558-561. 2 Banchereau J，Briere F，Caux C，et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol， 2000， 18： 767-811. 3 Porgador
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