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1、3 3 6 实 验 习干 究 人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和 纯化 李文娟陈伟朱任之付小兵 【 摘 要】 目 的 构建人瘦素因 子( L e p t in ) 的 原核表达质粒p G E X - 4 T - 3 - L E P ， 并诱 导该基因 在 原核细胞中大量表达。方法采用逆转录一 聚合酶链反应( R T - P C R ) 和D N A重组技术， 从人皮肤成 纤维细胞内 将编码人L e p t in 的c D N A序列克隆至原核表达载体p G E X - 4 T - 3 上， 选取阳性克隆扩增 后， 提取D N A进行酶切鉴定和测序。同时应用S D S - P A G E和蛋白质
2、印迹方法对其表达产物进行 特异性鉴定。 结果 克隆出的L e p t i n 基因的c D N A由4 6 9 b p 组成， 包 括翻译起始密 码子、 编码序列 和终止密码子等部分， 含有L e t i n p 基因的c D N A的表达质粒p G E X - 4 T - 3 在D H 5 。 细菌体内能够表 达， 并且随着诱导时间的延长， L e p t i n 基因的表达量增加， 重组L e p t i n 蛋白主要存在于包涵体中。 结论 L e p t i n 基因可以 在原核细胞中获 得表达， 为深入研究该蛋白 在创伤愈合中的具体作用莫定 了基础。 【 关键词】 L e p t i
3、n 基因; 原核表达载体;克隆 F u s io n e x p r e s s io n a n d p u r it y o f h u m a n le p t in in E . c o li L I W e n -j u a n ， C H E N W e i , Z H 6 R e n - z h i , e t a l . * K e y R e s e a r c h L a b o r a t o r y o f W o u n d R e p a i r , 3 0 4 t h C l i n i c a l D e p a r t m e n t o f G e n e
4、r a l H o s p i t a l o f P L A, B e ij i n g 1 0 0 0 3 7 , C h i n a ( A b s t r a c t O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t t h e p l a s m i d o f p G E X - 4 T - 3 - L E P f o r L e p t i n w it h p ro k a ry o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p G E X - 4 T - 3 a n d i n d u c e t h e L e
5、 p t i n p r o t e i n e x p r e s s i o n i n E . c o l i D H 5 a . Me t h o d s R T - P C R t e c h n o lo g y in v it ro w a s u s e d t o c lo n e c D N A ( c o m p le m e n ta ry d e o x y r ib o n u c le ic a c id ) s e q u e n c e c o d in g h u m a n l e p t i n . D N A r e c o m b i n a t i
6、 o n m e t h o d w a s a d o p t e d t o i n s e rt t h e s e q u e n c e i n t o t h e m u l t i p l e c l o n i n g s i t e s o f p G E X - 4 T - 3 . R e s u l ts T h e c D N A s e q u e n c e e n c o d i n g l e p t i n w a s c l o n e d in t o t h e p r o k a r y o t i c e x - p r e s s io n v e
7、 c t o r p G E X - 4 T - 3 t o c o n s t r u c t p G E X - 4 T - 3 - L E P . T h e s e q u e n c e o f c D N A w a s id e n t i c a l t o c o d i n g f r a m e w o r k o f l e p t i n g e n e , w h i c h w a s c o m p o s e d o f t r a n s l a t i n g o r i g i n a l c o d o n , c o d i n g s e q u
8、e n c e a n d t e r m i - n a t i n g c o d o n ， C o n c l u s i o n T h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p la s m id p G E X - 4 T - 3 - L E P w a s s u c c e s s f u l l y c o n - s t r u c t e d . F r o m t h e b a s i s o f t h e w o r k , f u rt h e r r e s e a r c h o f w o u n d h
9、 e e l i n g w i t h l e p t i n c o u l d b e c a r r ie d o u t . K e y w o r d s L e p t in g e n e ; P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r ; C l o n e 瘦素( L e p t i n ) 是一种多功能的细胞因子， 与受体 特异性结合后， 诱导细胞内一系列信号传递， 最终导致 细胞核内特异的基因表达， 促进血管内皮细胞增殖， 加 速血管形成， 在创面愈合、 组织再生和糖尿病足溃疡治 疗过程中起重要的调节作用
10、1 , 2 1 。因此， 瘦素在创伤 修复， 组织重建和血管生成等领域具有广阔的临床应 用前景。本研究首先采用基因技术克隆出瘦素基因的 c D N A序列， 将其连接到高效表达载体中， 并诱导蛋白 表达， 为深入研究该蛋白的生物活性及其在创面愈合 中的作用奠定了基础。 材料与方法 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目( 3 0 4 0 0 1 7 2 ) ; 国家9 7 3 计划 资 助项 目( 2 0 0 5 C B 5 2 2 6 0 3 ) ; 国家杰出青年科学基金资助项 目 ( 3 9 5 2 5 0 2 4 ) 作者单位: 1 0 0 0 3 7 北京， 解放军总医院3 0 4 临
11、床部全军创伤修复重 点实验室( 李文娟、 陈伟、 付小兵) ; 兰州大学基础医学院病理教研室( 朱 任之) 1主要材料: 限制性内切酶 B a r n H I , K p n I , T 4 D N A连接酶及多聚核普酸激酶为T a K a R a 公司产 品。其他如: 克隆质粒p G E M - T - E a s y , p f u T a g D N A聚 合酶, M R N A分离试剂盒、 逆转录( R T ) 试剂盒、 聚合酶 链反应( P C R ) 产物纯化试剂盒为P r o m e g a 公司产品。 T r i z o l 总R N A试剂盒( G i b c o ) 。硝酸
12、纤维素膜， We s t - e rn显色试剂盒， 兔抗人L e p t i n 多抗， 山羊抗鼠I g 二抗 为美国S a n t a 公司产品。细菌E . c o l i D H 5 + 、 表达载体 p G E X - 4 T - 3 和人原代成纤维细胞为本室保存。L e p t i n 基因的引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。 2 . 人原代成纤维细胞总R N A的提取: 按T r iz o l 试 剂盒所述方法提取处于分裂增生期的人皮肤原代成纤 维细胞 的总 R N A 。用无 R n a s e水溶解总 R N A , 一 2 0 保存备用。取少量总R N A在紫外分光光度计
13、 3 3 7 下定量， 同时进行甲醛变性凝胶电泳， 检测所提取总 R N A的质量， 具 体方法参照 3 0 3 . m R N A的分离、 逆转录、 扩增和测序: 取适量总 R N A ， 遵循P o l y A T t r a c t ( m R N A I s o l a t i o n S y s t e m的操 作要求分离纯化m R N A后， 以O l i g o ( d T ) 为引物， 遵循 c D N A S y n t h e s i s S y s t e m操作步骤合成 d s c D N A 。以 d s c D N A 为模板， 以L e p t i n 基因的引物
14、进行P C R扩 增， 反应产物用1 . 4 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定， 目的D N A 片段的胶条用 P C R产物纯化试剂盒回收。纯化的 D N A 片 段插入p G E M - T - E a s y 克隆载体中， 挑取阳 性 克隆在A B I 3 7 7 全自 动测序仪上进行序列分析。 4 . 重组质粒的 构建: 将 纯化括的P C R 产物和原核 表达载体p G E X - 4 T - 3 用限制性内切酶酶切后， 在 T 4 D N A连接酶作用下进行重组连接， 得到重组质粒 p G E X 4 T - 3 - L E P ， 将 p G E X - 4 T - 3 - L E P转化
15、入菌株 D H 5 a ， 培养至吸光度达0 . 6 左右时， 加入异丙基书 - D 一 硫 代半乳糖昔( I s o p r o p y - p - D - t h i o g a l a c t o s i d e , I P T G ) 至终 浓度为1 m m o l / L ， 继续 3 7振荡培养 5 h 。收获菌 体， 悬浮于1 % T r i t o n X - 1 0 0 的T E中， 用超声波破碎 细胞， 离心收集上清， 沉淀依次用 8 %尿素洗涤溶解 后， 进行1 % S D S - P A G E电泳后， 用考马斯亮蓝染色。 5 . 包涵体的处理: 将 1 L菌液离心所得
16、到的菌体 重悬于3 0 m l 磷酸盐缓冲溶液( P B S ) 中， 加入5 m m o l / L 二硫苏糖醇( D T T ) ， 冰浴中超声波破碎3 0 m i n ， 低温 下1 8 0 0 0 r / m in 离心2 5 m i n 。弃上清， 用3 0 m l 包涵体 洗涤液( 3 0 %蔗糖， 1 0 0 m m o l / L N a C l , 5 0 m m o l / L T r i s , p H 8 . 0 , 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 ) 洗涤2 一 3 次， 保留沉淀， 加入2 0 m l 包涵体溶解缓冲液( 1 0 m m
17、o l / L T r is , 1 5 0 m m o l/ L N a C l , 1 m m o l / L E D T A , 2 m m o l / L D T T , p H 8 . 0 ) ， 然后加入十二烷基肌胺酸钠， 终浓度为 5 %， 室 温静置3 0 m i n 或 5 0 0 W功率超声 5 m i n , 1 8 O O O r / m i n 离心3 0 m i n ， 收集上清， 4 对 P B S 透析4 8 h以上复 性。 6 . 蛋白质We s t e r n 杂交: 采用B r a d e f o r d 法测定蛋 白含量。收获的蛋白经1 5 % S D
18、S - P A G E电泳分离后， 转移至硝酸纤维素膜上， 用 1 0 %小牛血清4 封闭过 夜， 加1 : 2 0 0 稀释的L e p t i n 一抗， 4 过夜， 洗膜3 次 后， 加入1 : 5 0 0 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗， 室 温1 h ， 洗膜3 次， 每次5 m i n ， 然后加入化学发光试剂 作自显影。 结果 1 . L e p t i n 基因成熟肤编码区。 D N A的获得及序列 分析: 根据编码人 L e p t i n 成熟肤c D N A的核昔酸序 列， 分别设计合成两条引物， 上游引物内带有限制性内 切酶B a m H I 的酶切位点和翻译起始密码子
19、A T G ; 其 序 列 为 : 5 - G G A T C C A T G G T G C C C A T C C A A A A A G T C C - 3 ， 下 游 引物 的序 列 为 5 - G G T A C C A G T G A C - C T T C A A G G C C T C A G3 ， 其上含有终止密码和K p n I 的酶切位点。提取人皮肤成纤维细胞总R N A后， 分 离m R N A ， 合成双链。 D N A ， 以双链。 D N A为模板， 设 计的特异核昔酸序列为引物， 用保真性强的p f u T a q D N A聚合酶催化进行P C R扩增， 获得
20、编码人L e p t i n 的。 D N A片段， 琼脂糖凝胶电泳的长度约为4 6 9 b y ， 与 实验预先设计的片段大小相符合。 2 . 克隆和测序: L e p t i n 基因的P C R产物经低熔点 琼脂糖分离、 纯化、 回 收和加尾后， 与p G E M - T - E a s y 载 体相连接， 构建的重组体转化 D H - 5 a 细菌， 筛选出的 阳 性克隆命名为p G E M - l e p t i n 。以提取的重组质粒为 模板， 设计的特异核昔酸序列引物进行 P C R反应， 结 果发现能够扩增出4 6 9 b y 的D N A片段; p G E M - l e p
21、 t i n 质粒再用限制性内 切酶B a m H l 和K p n I 进行双酶切鉴 定， 酶切也得到4 6 9 b y 大小的D N A片段。这些实验 都 进 一 步 表明: L e p t in 基因 的c D N A 序 列已 克隆 成功。 对克隆到p G E M - T - E a s y 质粒的c D N A片段进行核昔 酸序列测定表明， 与报道的人L e p t i n 相应的c D N A序 列完全一致。由以上研究结果表明: 得到的c D N A片 段的核昔酸序列与报道的人L e p t i n 相应的c D N A序 列完全一致， 由翻译起始密码子 A T G 、 编码序列和
22、终 止密码子等部分组成。 3 . 表达载体p G E X - 4 T - 3 - L E P的构建及鉴定: 将 序列分析正确的p G E M - l e p t i n 质粒和p G E X - 4 T - 3 原 核表达质粒分别用B a m H l 和K p n I 酶切后， 回收目的 片段进行重组， 连接产物转化入E . c o l i D H 5 。 宿主菌， 选出抗氨节青霉素( A m p i c il l i n ) 的克隆， 命名为G E X - 4 T - 3 - L E P ， 提取质粒进行酶切鉴定， 泳道 5 为质粒的 双酶切结果， 切下一段核昔酸片段， 长度为4 6 9 b
23、 y ， 泳 道3 , 4 分别为p G E X - 4 T - 3 - L E P的B a m H l 和K p n I 单 酶切结果， 环状质粒变为线状， 泳动速率减慢; 与实验 设想完全一致。 4 . 人L e p t i n 在大肠杆菌中的诱导表达: 将原核表 达载体p G E X - 4 T - 3 - L E P 导入大肠杆菌D H 5 。 后， 在1 m m o l/ L I P T G存在条件下 3 7 诱导 5 h ， 裂解细菌 体， 进行S D S - P A G E 分析， 结果表明， 该重组蛋白L e p - t i n 在细菌体内得到高水平表达。其相对分子质量约 为1
24、 6 x 1 0 3 ， 与预期大小相一致， 该蛋白主要存在于包 涵体内， 包涵体大多可溶于包涵体溶解液中。包涵体 形式表达的融合蛋白用包涵体洗涤液洗涤后， S D S - P A G E电泳结果表明杂蛋白明显减少。用溶解液处理 后， 目的蛋白大部分溶于上清中。 3 3 8 5 . We s t e r n 杂交: 用兔抗人L e p t i n的抗体对表达 的融合蛋白 进行We s t e rn杂交， 可以发现表达的蛋白 能与抗体反应， 出现特异性的抗原抗体反应条带， 证明 该蛋白 是大肠杆菌表达的L e p t i n 蛋白。 讨论 人L e p t i n 是一种非糖基化蛋白， 分子结构
25、与I L - 6 细胞因子相似， 主要由白色脂肪细胞分泌， 在血液中含 量 与 体 重 指数 及 总 的 体脂 储备 相 关4 l o L e p 在 局 部以 旁分泌或自 分泌的方式通过与其受体( O B R ) 特异性结 合而 发挥其生理作用E 5 3 . L e p t i n 受体( O B R ) 是由d b 基 因 编 码， T a r t a g lia 等 “ 人 从小鼠 的 脉络丛组织细胞 内将该基因鉴定出来。O B R至少有 6 个亚型， 其中仅 含由3 0 1 个氨基酸组成的胞质区域的长型 O B R具有 信号转导的能力。本研究从人成纤维细胞中克隆出编 码L e p t
26、i n 基因的编码c D N A ， 并构建其原核表达载体， 为深入研究L e p t i n 蛋白因子的生物活性、 蛋白质半衰 期及其临床应用奠定基础。 哺乳动物基因在真核细胞中可以有效地转录和翻 译， 准确地完成糖基化、 磷酸化、 二硫键的形成以及翻 译后剪切等加工过程， 蛋白的结构和功能与野生型天 然蛋白 基本一致， 维持其全部活性 7 l 。 但是哺乳动物 细胞培养较困难， 且成本较高， 周期长， 表达外源基因 技术要求高， 而且一般蛋白表达水平都不理想， 较原核 系统低得多， 因此对于分子量较小的蛋白因子， 如能够 在原核细胞中维持其活性， 一般不选择在真核系统中 表达。在本研究中，
27、 我们初步发现原核细胞表达的 L e p t in 因子具有促进组织修复的活性， 但其详细测活 和其半衰期有何变化等方面还需进一步深入研究。 在本研究中， 我们应用p G E X - 4 T - 3 原核表达系统 表达L e p t i n 蛋白因子。该表达系统具有很多优点， 并 成功应用于多种蛋白的表达， 但在实际操作中往往还 是存在形成包涵体的问题。这可能与表达用宿主菌的 选择、 生长及诱导温度、 诱导时的菌体密度、 诱导时间、 I P T G浓度等有关。本实验选择p G E X - 4 T - 3 作为表达 载体， 其原因主要为: 带有非常强的l a c 启动子， 受l a c 阻遏蛋白
28、的负调控; 方便翻译起始， 在构建的原核表达 质粒中， S D序列下游是G S T基因， 目 的基因接在G S T 下游， 当基因进行表达时， 产物为G S T和目的蛋白的 融合体， 融合蛋白的表达系统可以克服转录和转录后 水平对外源基因表达可能带来的不利影响; 利于产物 的分离纯化， 融合蛋白可通过谷胧甘肤- a g a ro s e 柱进 行亲和纯化， 再将其 G S T部分切除， 从而获得目的蛋 白。实验表明， 我们构建的p G E X - 4 T - 3 - L E P可以在 大肠杆菌中较高的表达。该蛋白的表达为进一步制备 该蛋白的抗体、 深入研究该蛋白在创伤愈合中的具体 作用奠定了基
29、础。 参考文献 1 Ma rt in P . Wo u n d h e a l i n g : a i m i n g f o r p e r f e c t s k i n r e g e n e r a t i o n . S c i e n c e , 1 9 9 7 , 2 7 6 : 7 5 - 8 1 . 2 S t e n f a n F , B ir g it S , H e ik o K , e t a l . L e p t i n e n h a n c e s w o u n d r e - e p i t h e l i a l - i z a t i o n a n
30、 d c o n s t i t u t e s d i r e c t f u n c t i o n o f l e p t i n i n s k i n r e p a i r . J C l i n I n - v e s t , 2 0 0 0 , 1 0 6 : 5 0 1 - 5 0 9 . 3 陈伟， 付小兵， 王海滨， 等. 增生性瘫痕形成和成熟过程中转化生长 因 子 一 R 1 及下游信号分子的 基因表达变化. 中华实验外科杂志 ， 2 0 0 5 , 2 2 : 7 4 0 - 7 4 2 . 4 P r o l o P , Wo n g M, L i c i n i
31、o J . L e p t i n . I n t J B i o c h e m C e l l B i o l , 1 9 9 8 , 3 0 : 1 2 8 5 - 1 2 9 0 . 5 R e s e l a n d J E , S y v e r s e n U , B a k k e 1 , e t a l . L e p t i n i s e x p r e s s e d i n a n d s e - c r e t e d f r o m p r i m a ry c u l t u r e s o f h u m a n o s t e o b l a s t s a
32、 n d p r o m o t e s b o n e mi n e r a l i z a t i o n . J B o n e Mi n e r R e s , 2 0 0 1 , 1 6 : 1 4 2 6 - 1 4 3 3 . 6 T a r t a g l i a L A , D e m b s k i M, We n g X , e t a l . I d e n t if i c a t io n a n d e x p r e s s io n c l o n i n g o f a l e p t i n r e c e p t o r , O B - R. C e l
33、 l , 1 9 9 5 , 8 3 : 1 2 6 3 - 7 1 . 7 叶雄俊， 常智杰， 林桂亭， 等. 激活转录因子5 的克隆及其在真核细 胞中表达定位. 中华实验外科杂志， 2 0 0 5 , 2 2 : 7 0 5 - 7 0 7 . ( 收稿日 期: 2 0 0 5 - 1 1 - 2 2 ) 欢迎订阅 消化外科 杂志 ( 消化外科) 杂志由 重庆市科学技术协会主管及主办， 第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所承办。主编黄志强院士， 编 辑部主任董家鸿教授， 常务副主任陈敏副教授， 编委由1 0 0 余名海内外著名消化外科专家组成。国内外公开发行， 刊号I S S N 1 6
34、 7 1 - 4 5 5 5 , C N 5 0 - 1 1 4 1 - R ， 双月刊， 大1 6 开本， 铜版纸印刷， 每期8 0 页， 单月2 0日 出版， 定价1 2 . 0 0 元/ 册。国内邮发代号: 7 8 - 1 1 7 ( 重庆 市报刊发行局) ; 国外邮发代号: B M1 8 1 3中国国际图书贸易总公司) 。( 消化外科 杂志已被遴选为中国科技论文统计源期刊、 中国 自 然科学类核心期刊， 并被中国学术期刊( 光盘版) 、 万方数据库、 中国期刊网、 中国科技期刊引文数据库等收录。是目 前国内唯一 涵盖消化外科各领域的专业期刊。 ( 消化外科 杂志办刊方针: 着重提高，
35、兼顾普及; 办刊宗旨: 传播消化外科领域的新理论、 新技术和新经验， 立志成为联系国内 外消化外科同道的纽带， 推动我国消化外科学的发展。学术内容涵盖消化外科各领域， 包括食道、 胃肠、 肝、 胆、 胰、 血管、 内镜、 介入 治疗及外科营养支持等及其相关学科。学术性与实用性相结合， 医学基础理论与疾病防治实践相结合。栏目设置: 专家论坛、 述 评、 今日外科、 实验研究、 临床研究、 影像集锦、 大巡诊、 综述等。欢迎广大医务工作者投搞和订阅。 编辑部地址: 重庆市沙坪坝区 高滩岩2 9 号 消化外科) 编辑部 邮政编码: 4 0 0 0 3 8 电话: 0 2 3 - 6 8 7 5 4 6 5 5 传真: 0 2 3 - 6 5 3 1 7 6 3 7 E - m a i l : d i g s u r g ) 2 6 3 . n e t联系人: 陈敏 邹迎芬