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1、收稿日期： ! “ “ ! # “ $ # ! % 基金项目： 广东省自然科学基金资助项目 （“ ( 2 , = 5 ?$ 2 + ? 6 = 3】A B = C D E B F = ? 5 = 2 E ? 2 F = B G H 6 ? 6 B G 3 I B F5 2 J 4 GG = 2 F 4 E 3 ? = J = E E 3 4 G H ? B 6 G = 3 ? 6 K 4 ? = ? 5 =D 4 3 3 4 K 6 G KJ = ? 5 B H * 【1 = ? 5 B H 3】A 5 = = E E 3 I F B J? 5 = = J - F L B G 6 5 2 J
2、4 G- F 4 6 G B F ? 6 = CM = F =J = 5 4 G 6 4 E E LH 6 3 3 B 6 4 ? = H *N = E E 3M = F = 2 E ? 2 F = H 6 G, !J = H 6 2 JM 6 ? 5 - . / .4 G H0 / .，4 G H 6 H = G ? 6 I 6 = H - L 6 J J 2 G B L ? B 5 = J 6 3 ? F L *【7 = 3 2 E ? 3】, = 2 F 4 E 3 ? = J = E E 3 I F B J4 - B F ? 6 = = J - F L B G 6 5 2 J 4 G
3、3 5 4 H - = = G 3 2 8 = 3 3 I 2 E E L 2 E ? 2 F = H *A L D 6 4 E G = 2 F B 3 D 5 = F = 3M = F = H = = E B D = H 6 G3 2 3 D = G 3 6 B G，4 G HJ 4 = E E 3 = C D F = 3 3 = H 6 J = G ? 6 G4 G H1 2 3 4 3 5 6 E， M 5 6 5M = F = ? 5 =J 4 F O = F 3 I B F G = 2 F 4 E 3 ? = J = E E 3 *A 5 = = E E 3 B 2 E HH 6 I
4、 I = F = G ? 6 4 ? = 6 G ? BG = 2 F B G 3 4 G H4 3 ? F B L ? = 3 *, = 2 F 4 E 3 ? = J = E E 3J 2 E ? 6 D E 6 = H = F L 3 E B M E L2 G H = F ? 5 = 2 E ? 2 F = B G H 6 ? 6 B G 3，4 G H ? 5 = - = 3 ? = C D 4 G 3 6 B GM 4 3 4 5 6 = = HM 5 = G ? 5 = G = 2 F B 3 D 5 = F = 3M = F = H 6 3 = ? = H 6 G ? B 3 =
5、 = F 4 E D 4 F ? 3 4 G H ? 5 = = E E E 6 G OM 4 3 B G 3 = F = HM 5 = GD 4 3 3 4 K 6 G K * 【N B G E 2 3 6 B G】P 2 J 4 GG = 2 F 4 E 3 ? = J = E E 3 4 G- = 2 E ? 2 F = H I F B J= J - F L B G 6 - F 4 6 G 3 *A 5 = L I B F J = H ? 5 = ? L D 6 4 E G = 2 F B 3 D 5 = F = 3 6 G 3 2 3 D = G 3 6 B G 6 G 6 ? F B
6、，M 5 6 5 3 = F = 3 4 3 D B ? = G ? 6 4 E 3 B 2 F = I B F ? F 4 G 3 D E 4 G ? 4 ? 6 B G 6 G ? F = 4 ? 6 G KN , Q H 6 3 B F H = F 3 6 G 5 2 J 4 G 3 * ; # = E E；= J - F L B； = E E 2 E ? 2 F = 对神经变性疾病和神经损伤的外科和药物治 疗能取得一定疗效， 但在临床上长期应用药物治疗 有严重的副作用， 外科治疗的长期疗效不理想。在 对这些传统的治疗方法进行完善和优化的同时， 另 一种治疗方法细胞治疗， 现在已进行临床
7、实验。 将人胚胎组织来源的腹侧中脑移植到帕金森病人 的纹状体， 可明显改善病人的疾病症状 液中。用吸管反复抽吸脑组织约# $ 次， 使细胞分散成单细胞悬液， 离心 2（!$ $ $ ? !） ， 弃上清。- #培养基重悬细胞， 细胞计数器下 计数细胞， 将细胞种植在5 4 2； , O P洗5 次， 每次 2； # 4 R ( 2S 9 ! $ $处理! 2； , O P洗5次， 每次 2； 含有! $= 8 8马血清的 一抗5 HJ处理! 4 2；* . / 0结合的兔抗鼠. 7 )二抗5 HJ孵育! :；, O P洗5次， 每次 2； 荧光染色直接在荧光显 微镜下观察、 照相。 # 结果
8、# 4 ! 原代培养神经球的形成 原代培养细胞为小圆形细胞， 培养皿内培养5 N， 可见细胞开始聚集成球， 称为神经球 （2 F 1 Q ( 9 ; G : F Q F） ， 成悬浮状态。! C和波形蛋白 （图#， 图5） ， 表明 它们的神经干细胞属性。波形蛋白的阳性部位是 胞质中， 早期伸出的突起也呈阳性表达， 细胞核无 表达。A 1 ; : C的表达部位与波形蛋白类似。分 离的单细胞贴壁后 （体外培养一个月） 加入含# $7 8胎牛血清的%A B A* ! #培养基， 不加I * ) *和 B ) *， 继续培养! #N， 细胞固定后行免疫细胞化学 检查。可见散在的) * + ,阳性细胞
9、， 细胞呈多角 形， 类似0 6胶质瘤细胞形态； 部分细胞呈典型的神 经元形态， 表达- *。另有少数细胞 （约! K） 既不 表达) * + ,也不表达- *， 而表达环核苷酸磷酸二 酯酶， 为少突胶质细胞。 5 讨论 5 4 ! 神经干细胞的长期培养方法的改进 最近对人类克隆和移植的报道很多， 但极少有 文献对人类神经干细胞的增殖潜能进行系统研究。 对胚胎小鼠的纹状体神经干细胞应用B ) *培养可 以形成神经球， 可以进行长期培养， 成指数生长， 在 移植和分化后主要转化为星型胶质细胞 。然而 在同样的生长条件下， 大鼠的神经干细胞在!H !5 第6期郑佳坤， 等T人类神经干细胞的长期培养
10、和传代 万方数据 周的分裂后就停止增殖 ! 。我们在研究中也发现， 人类的神经干细胞在培养的早期阶段细胞分裂的 速度较快， 经过几次传代以后， 细胞分裂速度明显 减慢， 此细胞对密度特别敏感， 仅在神经球中有细 胞分裂和增殖， 很难见到孤立的细胞分裂， 克隆实 验没有成功。每次传代时， 机械方法制成单细胞悬 液后都有部分的细胞死亡， 其余的细胞在“ #$内 形成神经球， 以后又开始分裂和增殖。 神经球增大到一定程度时， 位于中心区的细胞 的营养供应必然缺乏， 如果不进行传代， 细胞必然 凋亡或坏死， 扫描电镜检查在神经球的中心有凋亡 细胞 % 。蛋白， 其中7 8 + 9 + $ : ;蛋白在
11、种属间的构造特别保守， 用小 鼠的7 8 + 9 + $ : ;抗体可以对人类、 鸟类及低等的脊椎 动物的神经干细胞进行鉴定 # 。本研究中应用 7 8 + 9 + $ : ;抗体对人类神经干细胞进行鉴定的结果 与波形蛋白的鉴定结果基本相同， 表达部位也相 似。神经干细胞开始分化后， 波形蛋白和7 8 + 9 + $ : ; 的表达均下调， 2 1 1的表达同时上调。 5 6 5 成年脑内的神经干细胞对于组织修复的意义 近来的研究证明， 不仅在胚胎期的脑组织中存 在神经干细胞， 在很多的成年的哺乳动物脑室下 区， 齿状回能持续产生神经元 ? 。在体外培养各种 生长因子的刺激条件下， 这种成体来
12、源的神经干细 胞如果能大量扩增， 则可做为人神经组织移植的另 一可靠的来源。体外研究已证实了成人脑内存在 神经干细胞， 在成人脑内究竟这种细胞能否分裂， 3 : A + + B )的研究对此问题给出了明确的答案。一 个黑色素瘤病人在生前应用了大剂量的C * D， 目 的是确定瘤细胞的增殖速度， 病人死亡后的尸体解 剖研究中， 在海马齿状回中发现了C * D阳性细 胞 0 . 。这种细胞是新产生的， 即成人脑内存在能 持续分裂的细胞。但目前还不清楚这种细胞的多 能性， 它们可能代表一群处于静止状态的干细胞， 或是能持续分裂的神经元前体细胞。E B F等从成 年人的海马组织中分离提纯获得神经元前体
13、细胞， 这种细胞可以在体外培养的条件下增殖 0 0 。最 近， 2 9 G (等采用贴壁培养的方法从尸体的脑组织 中分离培养出神经干细胞， 细胞增殖速度较慢， 经 多次传代后分裂次数减少， 诱导分化后可分化为神 经元和胶质细胞 0 - 。 总之， 目前可以肯定的是在成人脑内的一定区 域有神经元新生。因此， 将来的一个治疗策略就是 如何对成人的神经干细胞培养和扩增 （理想状态是 从需要移植的病人取出细胞培养， 大量扩增后再移 植给病人自身， 这样可以免除免疫排斥） 。另一个 策略是刺激脑内的细胞在原位分裂， 移行和修复受 损的神经元。随着人类神经干细胞的体外培养和 定向分化的技术的进步， 神经细
14、胞移植在不久的将 来必将走向临床。 （本文图0“5见插页5 H1 : G H 0“5+ $ B I ): )J 9 K A K B ; B 8 ( *L 9 G ( 5） 参考文献： 01 ( ( *ME，2 ( ( ) (=3，C ( ( N (E3，! “# $6O 9 ) + L ; 9 ) P 9 P : B )B Q ( / J F B ) : K * B L 9 / : ) () ( 8 B ) + Q B + ( ( (= 9 A : ) + B )+* : + ( 9 + ( R 6 ( I3 ) G ; R7 ( *，- . . 0，5 “ “ （0 .） ： , 0 . 6
15、 - ; P $ ( 9 L F: )P $ () ( B 8 + F + P ( /R6 O ( ) * + ( 8 B + K :，0 ? ? ?，- - （#） ： 5 ! , 6 5M 9 L ( ) P ( 7S， M 8 :T，U 8VW，! “ # $6 X ) : P B ( Y L 9 ) + : B )B Q $ 8 Z / 9 ) ( 8 9 ; L B G ( ) : P B K ( ; ; + R 63 Y L ( 8 B ;，0 ? ? ?，0 ! # （-） ： - % ! 6 “E ( F ) B ; * +C， 1 9 I K ( P P R，C ( ) P ; 9 G (M，! “# $6 X ) K ( 9 + ( *+ 8 Z : 9 ; B Q 9 P3 2 1 Z G ( ) ( 9 P ( *M ; +8 + : ) GC - ,+ 8 L Z L ; ( / ( ) P ( */ ( * : 8 / R 6 ( C 9 : )E ( +，0 ? ? !，0 . - （5） ： “ . , 6 （下转第“ ! “页 P BL 9 G ( “ ! “） -5“ 中山医科大学学报 （ ? 2A （1） ： “ = ! ( 1 1） ： 7 “ ） 万方数据 万方数据