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1、第1 0 卷第10 期 2 0 0 8 年1 0 月 辽宁中医药大掌学报 J O U R N A LO FU 【A O N I N GU N I V E R S I T YO FT C M V o L l ON 仉l O O c t 2 0 0 8 人胚胎肝细胞体外培养相关技术研究进展 彭岳。赵铁建 ( 广西中医学院，广西南宁5 3 0 0 0 1 ) 摘要：肝脏是人体代谢、生物转化的重要器官。肝脏疾病临床、药物代谢以及药效药性评价等医药研究都需 要一个肝脏的体外模型作为研究平台。目前国内外研究认为，人胚胎肝细胞是构建肝脏体外研究模型的较理想材 料。随着肝脏临床及基础研究的日益深入，对胚胎肝细
2、胞体外模型的数量和质量的要求将越来越高。主要对人胚 胎肝细胞的分离、培养、鉴定及冻存技术的研究进展进行综述。 关键词：人胚胎肝细胞；分离；培养；鉴定；冻存 中图分类号：R 一3 3文献标识码：A文章编号：1 6 7 3 8 4 2 X ( 2 0 0 8 ) 1 0 - 0 0 4 4 - 0 3 T e c h n i q u e so fi nv i t r oc u l t u r eo fL i v e rc e l l so fm a n se m b r y o ：R e s e a r c hp r o g r e s s P E N GY u e ，Z H A OT i e -
3、 j J a n ( G u a n g x iC o l l e g eo fT C M ，N a n n i n g5 3 0 0 0 1 ，G u a n g x i ，C h i n a ) A b s t r a c t ：T h el i v e ri so r g a no fi m p o r t a n ts u p e r s e s s o no fh u m a nb o d y W en e e dab o d yo u m i d em o d e l t od ot h er e s e a r c ho fc u r i n gt h ed i s e a s
4、eo fl i v e r ，t h es u p e r s e s s o no fd r u g s ，t h ep o t e n c ya n de v a l u a t i o nt h e p r o p e r t yo fm e d i c i o n T h ec e l lo fl i v e ro fm a n se m b r y oi sam o r ei d e a lm a t e r i a lt of o r mab o d yl i v e ro u t s i d e m o d e l S ot h i st h e s i sm a k e st
5、h er o u n d u pt ot e c h n o l o g yo fs e p a r a t e s ，d e v e l o p ，f r e e z ea n dk e e po ft h ee e Ho f l i v e ro fn w m se m b r y o K e yw o r d s ：T h ec e l lo fl i v e ro fm a r t se m b r y o ；S e p a r a t e ；D e v e l o p ；A p p r a i s e ；F r e e z ea n dk e e p 肝脏是生理和病理状态下药物代谢的
6、重要器 官，通过肝脏的代谢作用，许多内源性和外源性物 质( 如药物) 对人体的效应、药性或毒性作用都将被 减弱甚至消除。作为这样一个在生物转化过程中的 重要发生器官，肝脏就必然成为药物研究中的重要 靶器官。研究者们常采用一系列的体外研究方法来 研究药物经过肝脏的代谢情况和代谢机制。在这些 体外研究中，需要一个与人体肝脏代谢性能高度相 似的体外模型，体外培养的人源性肝细胞由于其具 有与人体肝脏一致的生物学特性和良好的体外实验 重现性，无疑成为构建体外研究模型的最佳材料u 】。 体外肝细胞根据其来源有原代肝细胞和胚胎肝细胞 两种，虽然原代肝细胞的功能最接近在体肝脏，但原 代肝细胞的体外培养增殖和传
7、代相当困难，而且成 人肝组织的来源也受到很大限制1 2 1 。而人胚胎肝细 胞来源较广泛，体外增殖能力强，所以目前其作为肝 细胞体外培养的来源引起了研究者们的高度重视。 本文主要对人胚胎肝细胞的分离技术、培养方法及 冻存研究的进展作一综述。 1 胚胎肝细胞培养的实验取材 材料主要选择1 2 2 4 周的引产死胎，胎儿的母 亲健康，肝功能正常，H B s A g ( 一) 。引产后如需要保 存，必须低温，并要保持胎盘、脐带与胎体连接完整， 防止细菌污染胎体腹腔p 】。经伦理委员会同意，并 签署知情同意书。 2 胚胎肝细胞的分离 目前广泛应用的人肝细胞分离技术是S e g l e n 创 立的胶原
8、酶两步法灌注分离技术H 。具体步骤：将 死胎置于无菌托盘中，常规消毒腹部，铺单后打开腹 腔，显鼹并游离门静脉后，插管并固定。首先用离子 鳌合剂如E D T A ( 或者E G T A ) 的无菌c a 2 + 缓冲液( 保 持3 7 ，p H 7 4 ) ，以2 0 m l J m i n 的速度灌入，目的是洗 尽肝脏中的积血，并除去C a 2 + ，打破细胞间桥粒的紧 密连接。随后待肝脏充盈时，于下腔静脉插管放出 肝内的积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉。灌注 5 m i n ，至肝脏表面呈现黄色后，用D H a n k s 液洗尽肝 脏内的E D T A 。接着，用含c a 2 + 的0
9、0 5 9 L 胶原酶缓 冲液( 也是3 7 ，p H 7 4 ，一般用型胶原酶) 持续灌 注肝脏5 1 0 m i n ，消化组织。取下肝脏，置于含4 H a n k s 液的平皿中，剪开肝包膜，疏下肝细胞，以单 层的无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以1 0 0 目及 2 0 0 目筛网过滤，5 0 0 r r a i n 清洗离心3 次，每次2 m i n ， 弃上清，以4 H a n k s 液重悬，用台盼蓝染色法例测 定分离肝细胞的活率【细胞活率= 活细胞总数“死 细胞+ 活细胞) 1 0 0 】，肝细胞活率 9 0 时，计数 制成肝细胞悬液。整个胶原酶两步法灌注分离技术 最重要的是要
10、清洗干净肝脏内的积血和对肝细胞 悬液的离心清洗。最近个意大利研究小组设计了 一种改良四步法来分离人肝细胞【6 1 ，目的是减小缺 血再灌注损伤及提高细胞分离后能量状态，从而提 高分离后肝细胞的活性。与传统两步法相比，其在 E D T A 灌注前及胶原酶灌注后采用含甘氨酸、丙氨 酸及果糖等基质的灌注液灌注，以促进肝细胞分离 后的能量恢复。分离出的肝细胞的数量及活性，主 要取决于组织质量、供肝冷缺血时间、灌注液成分、 胶原酶类型和浓度1 7 1 。 收稿日期：2 0 0 8 - ( M - 0 1 基金项目：国家自然科学基金课题( 3 0 7 6 0 3 2 1 ) ；广西壮族自治区自然基金课题(
11、 桂科自0 5 4 2 0 9 6 ) 作者简介：彭岳( 1 9 8 1 一) ，男，广西南宁人，执业医师，硕士研究生，研究方向：中医药对肝细胞功能的调节。 够。4 4 参 万方数据 1 0 卷 辽宁 中医药大学学报 3 胚胎肝细胞的培养 将肝细胞悬液以终浓度1 1 0 5 ，m I 接种于塑料 培养瓶内或六孔培养板中，内置玻璃爬片。在3 7 ， 5 0 m I L 孵箱中培养，第2 天要换液，以后隔天换液。常 被选用的培养基有D M E M F 1 2 和R P M I 一1 6 4 0 等隅】。 为了肝细胞能很好的保持其生物活性，需要加入 各种复杂的培养基质和添加物。应用细胞外基质 ( e
12、 x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，E C M ) 作为辅助成分可促进细胞 在体外的黏附和增殖，这种方法已广泛用于细胞培 养。常用的基质成分包括I 、和V 型胶原，层 粘连蛋白1 、肌腱蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白 等【9 】。多数研究者采用胶原作为肝细胞培养的细胞 外基质，并发展了“三明治夹心”培养法，即把细胞 放在两层胶原中进行培养，更有效的维持了肝细胞 的各种特性 1 0 1 0 最近，K a t s u r a 等【l u 发展了一种培养 体系，能够长期培养人肝细胞并能保持肝细胞的分 化功能。他们发现人肝细胞在添加了1 0 人血清、 1 0 m
13、 m o l f L 烟酰胺、l O n g m LE G F 、0 5 g m L 胰岛素、 1 0 7 m 0 1 L J 也塞米松及抗生素的角蛋白刺激因子培 养基中可以存活超过5 6 天。 4 胚胎肝细胞的鉴定 4 1 细胞形态的观察培养过程中需要用倒置相 差显微镜连续观察并显微摄影记录细胞生长的状况 并在电子显微镜下观察细胞的超微结构。 4 2 细胞生长曲线的测定用此曲线来检测肝细胞 增殖的活力。将肝细胞悬液以1 0 3 浓度接种于9 6 孔 板内，3 7o C ，5 0 m J L 的C 0 2 孵箱内培养，每天取8 孔 加入M T r 溶液2 0 斗u 孔，3 7 继续孵育4 h
14、，终止培 养，吸去上清，加入1 5 0 肛L 的L D M S O ，振荡l O m i n ， 在酶联免疫检测仪上选择4 9 0 n m 波长，测定光吸收 值，取平均值，连续测定1 2 天。以时间为横坐标，光 吸收值为纵坐标，绘制出细胞生长曲线 1 2 1 0 4 3细胞克隆形成率将肝细胞以1 个细胞孔的 密度接种于9 6 孔板内，连续培养1 5 天，在倒置显微 镜下观察含有5 0 个以上细胞的细胞克隆数 1 3 1 0 按 下列公式计算细胞克隆形成率：克隆形成率( ) = ( 克隆数接种细胞数) X1 0 0 。 4 4 软琼脂试验在6 0 r a m 培养皿中预先铺上含 1 2 9 r
15、L 琼脂的培养基，将悬液中的肝细胞细胞以1 1 0 5 1 1 1 I 浓度与3 7 预温的含6 f f L 琼脂的培养基混匀 后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养2 0 天后观察克隆形成数4 J 。 4 5 染色体检查取对数生长期的肝细胞，加入 终浓度为0 5 m g L 的秋水仙碱，继续作用4 d x 利“ ，收 集分裂中期细胞，离心去上清，加0 0 7 5 m o l 的K c l 低渗处理2 0 r a i n ，最后经甲醇一冰乙酸圊定，制片， G i e m s a 染色后，在油镜下观察染色体形态【l ”。 4 6 免疫组织化学法用此方法来鉴定细胞的表 型。分单染色法和双染色法
16、两种。 5 胚胎肝细胞的培养结果 5 1传代人胚胎肝细胞体外增殖能力很强，贴壁 牢固。所以其传代较为困难，即使延长消化时间及 增加酶的浓度，肝细胞受损相当严重，仍难以从瓶底 上消化下来。 5 2 收获细胞的形态特征观察光学显微镜下观 察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较 快。透射电镜观察，细胞呈圆形或卵圆形，体积明显 小于肝细胞，但形态和结构基本与肝细胞相同。细 胞核仁增大，胞质少( 核浆比较小) ，胞内含丰富的糖 原颗粒，细胞极性恢复，可见紧密连接和毛细胆管形 6 胚胎, W - 细胞的冻存 肝细胞的获得是不确定的，一旦获得，将会分 离出大量的肝细胞( 超过1 0 9 个) ，通常
17、超过了研究 所需。这样，许多肝细胞将会被浪费掉。虽然肝细 胞可以短期保存在U W 液中n ”，但是仍需要发展长 期保存肝细胞的冻存方法，以期其获得在研究及临 床中最大限度的应用。任何冻存方法的最终目的， 都是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形 成，从而保持解冻后细胞活性、粘附能力及代谢活 性。一个成功的冻存方法主要取决于冻存速度、冻 存肝细胞的浓度、冻存保护剂的类型及终浓度等1 1 9 1 。 许多研究应用计算机程序冷冻仪来控制温度，使其 以更精确的方式下降，从而避免悬液中细胞内冰晶 的形成。G u i l l o u z o 等回顾了近几年研究文献，结 论是没有可信的证据表明复杂的程序降
18、温比普通 的一2 0 然后一8 0 的两步降温法更有利。最近， A 1 e x a n d r e 等口u 比较了计算机控制型冷冻仪实现的 阶梯式降温法( s t e p w i s e f r e e z i n g ，S F ) 与异丙醇冷冻 仪实现的逐步降温法( p r o g r e s s i v ef r e e z i n g ，P F ) ，发现 细胞总复苏率P F ( 3 8 3 ) - 奇于S F ( 1 2 2 o D M S O ( 二甲基亚砜) 在多数研究中用来作为冻存保 护剂。聚维酮是另一种冻存剂，它可以保护细胞 的亚结构【2 1 1 。目前尚未有一个标准的冻存方法
19、。仍 需进一步研究发展理想的肝细胞冻存技术。 人胚胎肝细胞的体外培养，为肝脏生物转化途 径的研究，探索药物的作用、代谢过程提供了个简 单和有效的模型。随着肝脏临床及基础研究的日益 深入，对胚胎肝细胞体外模型的数量和质量的要求 将越来越高。近年胎肝细胞体外培养的技术已经得 到了较大的发展，但培养得出的细胞在组织分化上 还不太成熟，且培养过程中的各项具体技术上欠缺 仍然较大。研究人员应结合目前先进的分子生物学、 细胞生物学及免疫组织化学技术，进一步改进和发 展胎肝细胞的体外培养方法，为今后能合理地应用 此项技术进行肝病临床研究，药理毒理学及药物效 用评价、筛选等研究提供可靠的理论及实验依据，以 及
20、提供理想而充足的细胞材料。 参考文献 【1 】N a t ；a m H 。I t o M ，S h i r o t a C ，e a 1 R o u t e o f h e p a t o c y t e d e l i v e r y a f t - e c t sh e p a t o c y t ee n g r a f t m e n ti nt h es p l e e n 【J 】T r a n s p l a n t a t i o n ， 2 0 0 3 2 7 ：7 3 2 7 3 4 【2J B e r n a lW ，W e n d o nJ L i v e rt r a
21、 n s p l a n t a t i o ni na d u l t sw i t ha c u t el i - v e r f a i l u r efJ 】JH e p a t o l ，2 0 0 4 ，4 0 ：1 9 2 - 1 9 7 【3 1 何念海，赵文利，王宇明，等人胚胎间充质干细胞体外分离培 养和生物学鉴定 J 1 肝脏，2 0 0 5 ，1 0 ( 3 ) ：1 8 2 1 8 5 【4 】K e r k h o v e M P ，H o e k s t r a k ，C h a m u l e a u R A ，e t a l C l i n i c a la p
22、 p l i c a - t i o no f b i o a r t i t l e i a l l i v e rs u p p o r ts y s t e m s 【J 】A n n S u r g ，2 0 0 4 ，2 4 0 ( 2 ) ：2 1 6 - 2 3 0 【5 】黄柏英，余剑英，祝和成人胚肝细胞分离培养研究【J 】湘南 学院学报，2 0 0 5 ，7 ( 1 ) ：1 0 - - 1 4 【6 】B a c c a r a n i U ，S a n n a A ，C a r i a n i A ，e t a l I s o l a t i o n o f h u m
23、a n h e p a t - o c y t e sf r o ml i v e r sr e j e c t e df e rl i v e rt r a n s p l a n t a t i o no na n a t i o n a l b a s i s ；r e s u l t so f a 2 - y e a r e x p e r i e n c e 【J 】L i v e r T r a m p l ，2 0 0 3 。9 ： 5 0 6 - - 5 1 2 【7 】李涛彭志海人肝细胞的分离，培养和冻存【J 】国外医学外 科学分册，2 0 0 5 ，3 2 ( 2 ) ：9
24、 2 9 4 【8 】张淑莲，曾平鲁，肖荣，等肝干细胞分离培养条件的筛选【J 】 肝脏，2 0 0 3 。8 ( 1 ) ：3 1 3 2 【9 】W e i s sT S ，J a h nB ，C e t t oM ，e ta 1 C o l a g e ns a n d w i c hc u l t u r ea f f e c t s i n t r a c e l l u l a rp o l y a m i n el e v e l so fh u m a nh e p a t o c y t e s J 】C e l lP r o l - i f ，2 0 0 2 ，3 5 ( 5
25、 ) ：2 5 7 2 6 7 【1 0 】邓颖，陈杰，毕惠嫦，等原代肝细胞培养及其在药物代谢和毒 理学研究中的应用进展【J 】中国药理学通报，2 0 0 6 ，2 2 ( 8 ) ： 9 0 0 9 0 3 1 1 】K a t s u r a N ，I k a i l ，M i t a k a T ，e l ：a 1 L o n g - t e r mc u l t u r eo f p r i m a r y - h u m a nh e p a t o c y t e sw i t hp r e s e r v a t i o no fp r o l i f e r a t i v e
26、c a p a c i t ya n d 髫么蓼 万方数据 第10 卷第10 期 2 0 0 8 年1 0 月 趸宁中医药大掌掌报 J O U R N A LO FL I A O N I N GU N I V E R S I T YO FT a V 0 1 1 0N o 1 0 O c t ，2 0 0 9 慢性肾小球肾炎蛋白尿中医药治疗进展 宋永亮1 ，孙伟2 ，于民权1 ( 1 南京中医药大学2 0 0 6 级硕士研究生，江苏南京2 1 0 0 2 9 ；2 江苏省中医院，江苏南京2 1 0 0 2 9 ) 摘要：通过对近几年中医对肾小球肾炎蛋白尿辨证及疗效的总结，以达到开拓思路，提高辨证
27、的准确性和疗 效的确切性。 关键词：慢性肾小球肾炎；蛋白尿；中医药疗法；综述 中图分类号：R 6 9 2 3 1文献标识码：A 文章编号：1 6 7 3 8 4 2 X ( 2 0 0 8 ) 1 0 - 0 ( H 6 - 0 0 C h i n e s eM e d i c l n eT r e a t m e n tD e v e l o p m e n to fC h r o n i cG l o m e r u l o n e p h r i t i sP r o t e i n u r i a S o N GY o n g l i a n g 。S U NW e i ，Y UM i
28、 n q u a n l ( 1 2 0 0 6g r a d ep o s t g r a d u a t eo fN a n j i n gU n i v e r s i t yo fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e ，J i a n g s u N a n j i n g2 1 0 0 2 9 ，C h i n a ；2 T C MH o s p i t a li nJ i a n g s uP r o v i n c e ，N a n j i n g2 1 0 0 2 9 , J i a n g s u ，C h i n
29、 a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v e ：S u m m a r yi ns y n d r o m ed i f 如r e n t i a t i o na n de f f e c to fg l o m e r u l o n e p h r i t i sp r o t e i n u r i a d u r i n gr e c e n ty e a r sm a k e1 1 8t od e v e l o p et I l o u g h ta n dt Oi m p r o v es y n d r o m ed i f f e r e
30、n t i a t i o na c c u r a c ya n d t h e r a p ye f f e c t i v et a n g i b i l i t y 。 K e yw o r d s ：C h r o n i cg l o m e r u l o n e p h r i t i s ；P r o t e i n u r i a ；C h i n e s em e d i c i n et r e a t m e n t ；R e v i e w 蛋白尿是慢性肾小球肾炎( C G N ) 主要临床表 现之一，是多种原因引起的有着不同病理免疫炎症 性疾病。随着病情进行性发
31、展，后期渐出现慢性肾 功能不全( C R F ) 。目前西医尚无满意疗法，而中医 药具有很大的发掘潜力。因此如何治疗C G N ，消除 蛋白尿，是中医临床研究的重要课题。现将近年来 有关文献综述如下。 1 病因病机 现代医学认为蛋白质是构成人体和维持生命 活动的基本物质，与中医学精气、清气、精微的概念 类似，蛋白尿可归属于精气下泄范畴。时振声】认 为蛋白尿与脾肾、肺、肝及风邪、瘀血密切相关。时 教授将蛋白尿的病机归于“精气下泄”范畴。时教 授认为，“精气”等宜藏不宜泄，肾为“封藏之本，受 五脏六腑。之精而藏之”；脾主统摄升清。若肾不藏 精，或脾不摄精，或脾不升清，便可致精气下泄而出 现蛋白尿。
32、综观慢性肾炎的基本病机，亦以脾肾虚 损贯穿始终，故似可认为脾不摄精、清气下陷和肾不 藏精、精气下泄是导致慢性。肾炎蛋白尿的直接病机。 格致余论谓：“主闭藏者肾也，主疏泄者肝也”，若 肝失疏泄，能致肾不闭藏，精气外泄。说明肝之疏泄 失常也可以形成蛋白尿。又如肺气贲郁，宣降不利， 脾气上输之清气不得归于肺而布散全身，径走膀胱， 亦可形成蛋白尿。人体感受风邪易致精气不固而形 成蛋白尿。“久病人络”、“久病必瘀”，瘀阻肾络，精 气不能畅流，壅而外溢，故精微下泄而成蛋白尿。 叶传蕙f 2 1 则认为蛋白尿的形成多以邪实为主， 即使本虚也为因实致虚。在邪实中以湿热最为多见。 湿热分外湿和内湿，外来湿邪多因
33、久居湿地或涉水 淋雨，湿邪侵犯人体皮毛肌肉，肺脾受邪，肺失通调 水道之功，脾失运化水液之职，水液停聚，聚而生湿； 水为有形之湿，湿为无形之水，水湿停滞，郁而化热， 形成湿热胶着之态；内湿的形成与饮食失调、劳逸 失常、七情内伤等有关，脏腑功能失调，湿浊内生，郁 而化热，热与湿合，而成湿热之证。湿热壅结，三焦 气化不利，肺失宣降，脾失布精，肾失封藏，开阖无 权，精微物质外漏而出现蛋白尿。因湿邪黏滞重浊、 缠绵难愈，而使湿热贯穿于整个肾炎发生、发展的过 程中，故湿热留恋是肾性蛋白尿反复发作迁延不愈 的重要因素。 d i f f e r e n t i a t e d f i m c t i o m
34、fJ 1 J S u r g R e s ，2 0 0 2 ，1 0 6 ：1 1 5 1 2 3 M o h r L ，S h a n k a r a S ，Y o o n S K 。e t a l G e n e t h e r a p y o f h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ai nv i t r oa n di nv i v oi nm u d im i c eb ya d e n o v i r a lt r - a n s f e ro fE s c h e r i c h i aC o l ip u r i n en u
35、c l e o s i d ep h o s p h o r y l a s eg e n e 【J 1 H e p a t o l o g y ，2 0 0 0 ，3 l ( 3 ) ：6 0 6 刘树人，刘灼亮，彭齐康，等乳猪肝细胞的分离培养及其功能 【J 】世界华人消化杂志，1 9 9 9 7 ( 5 ) ：3 7 5 李羽，白雪帆，徐哲，等永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物 学特性【J 】第四军医大学学报，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 1 ) ：9 7 1 9 7 4 陈慧梅，廖红，高静肝细胞培养方法研究进展【J 】细胞生物 学杂志。2 0 0 2 ，2 4 ( 3 ) ：1 6 3
36、 1 6 6 韩聚强不同取材来源肝细胞体外培养的比较【J 】河北医科 大学学报，2 0 0 l ，2 2 ( 5 ) ：2 6 9 2 7 2 毛海洲人胎肝干细胞的体外分离培养与鉴定【J 】世界华人 捎化杂志，2 0 0 5 ，1 3 ( 4 ) ：4 5 2 - 4 5 5 UC C ，L i uY F ，L i a n gJ I s o l a t i o na n dp r o t e c t i v ee f f e c ti nU 8 0 - - l u t i o no fh u m a nh e p a t o c y t e sd u r i n gc o l ds t o r
37、 a g e 【J 】I n tC o n g r S e r ，2 0 0 3 ，1 2 5 5 ：2 1 7 2 1 8 L l o y dT D ，O r rS ，S k e t tP ，e ta 1 C r y o p r e s e r v a t i o no f h e p a t o c y t e s ： ar e v i e wo fc u r r e n tm e t h o d sf o rb a n k i n g 【J1 C e l lT i s s u eB a n k 。 2 0 0 3 4 ：3 - 1 5 G u i l l o u z oA 。P d a
38、l l a n dL ，F a u t ，e lA 。e ta 1 S u r v i v a la n df o n c t i o no f i s o l a t e dh e p a t o c y t e sa f t e rc r y o p r e s e r v a t i o n 【J 】C h e mB i o lI n t e - t a c t ，1 9 9 9 。l ( 2 1 ) ：7 - 1 6 A l e x a n d r e E V i o o n A b a d i e C 。D a v i d P ，e ta 1 C r y o p r e s e r
39、v a t i o n o fa d u hh u m a n h e p a t o e y t e so b r a i n e df r o mr e s e c t e dl i v e rb i o p s i e s 【J 】C r y o b i o l o g y ，2 0 0 2 ，4 4 ：1 0 3 一1 1 3 0 s t r o w s k aA ，B o d eD C ，P r u s sJ ，e ta l ，I n v e s t i g a t i o no f f o n c t i o n a l a n dm o r p h o l o g i c a l
40、i n t e 研t yo ff r e s h l yi s o l a t e da n dc r y o p r e s e r v e d h u m n h e p a t o e y t e sIJ 】C e l lT i s s u eB a n k ，2 0 0 0 ，l ：5 5 - 6 8 收藕日期：2 0 0 8 - 0 4 - 0 3 作者简介：宋永亮( 1 9 7 3 - ) ，男，陕西宝鸡人，主治医师，硕士研究生，研究方向：益肾清利活血法治疗慢性肾小球肾炎。 镌4 6 1 J 1 J 1 J ，J 1 J 堪 侈 加 殂 砣 r L rL，L r L r L 1J，i 1 J ，J j 埒 M 塔 硒 玎 l rl r t r L 万方数据