人肝癌细胞系H4M的建立及其遗传特征分析.pdf

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1、收稿日期: 2 0 0 5 - 0 7 - 2 6 基金项目:国家自然科学基金资助( No . 3 0 1 0 0 2 1 8 ) 作者简介:王莉( 1 9 7 8 - ) ,女,陕西西安人,八一医院全 军肿瘤中心主治医师,硕士,从事肿瘤临床与基础研究. 人肝癌细胞系 H4 M 的建立及其遗传特征分析 王莉1,张萌2,郭爱林2,李青3 ( 1 .中国人民解放军八一医院全军肿瘤中心内科,江苏 南京2 1 0 0 0 2 ; 2 .中山医科大学病理教研室,广东 广州5 1 0 0 8 0 ; 3 .第四军医大学西京医院病理科,陕西 西安7 1 0 0 3 3 ) 摘要:目的采用原代细胞培养方法,在

2、体外建立一株人肝癌细胞系H4 M,并对其遗传学特征进行分析。方 法将分离的瘤细胞制成单细胞悬液,用含2 0 %胎牛血清的D ME M培养液培养该细胞系,采用染色体G显带方法 进行细胞遗传学分析,用对比基因杂交法分析肿瘤细胞基因组遗传学改变情况,并采用D NA- P C R方法检测等技术 分析该细胞系周期素D 1扩增情况。结果染色体G带显示H4 M细胞为超3倍体,其中有一条染色体含有一长的同 质染色区( h o mo g e n e o u s l ys t a i n i n gr e g i o n , h s r ) 。比较基因组杂交( C G H)分析显示, H4 M的细胞遗传学改变为2

3、 , 5 , 6 p , 7 p , 1 1 p , 1 3 q 2 1 . 3 - q t e r增加, 而1 1 q 1 3为高拷贝数扩增, 8 p t e r - p 1 2 , 9 , 1 3 q 1 1 - q 2 1 . 2 , 1 6 q , 1 7 p t e r - p 1 2 , 1 9 p和X p t e r - q 1 3丢失 。H4 M细胞系的C C ND 1基因有明显的扩增。结论 通过原代培养建立的肝癌细胞系H4 M与原发癌保持 相同的生物学特性,体外连续传代6 0代以上,细胞形态不变,生长周期恒定,可望成为一个稳定的细胞系。 关键词:癌,肝细胞/病理学;肝肿瘤/病

4、理学;染色体;杂交,遗传;细胞周期蛋白D 1/ 生物合成;肿瘤细胞,培 养的 中图分类号: R 7 3 5 . 7 ; Q2 9 1文献标识码: A文章编号: 1 0 0 1 - 1 6 9 2 ( 2 0 0 6 ) 0 4 - 0 3 1 9 - 0 4 原发性肝癌是消化道常见恶性肿瘤之一,在我 国具有发病率高、死亡率高及治愈率低等特点,因此 迫切需要寻求更加有效的治疗方法。肿瘤生物学治 疗是目前医学界的研究热点,本研究试图利用树突 状 细胞肝癌细胞融合法筛选HL A- 类抗原肽,从 而研制出新的肝癌疫苗。而对肝癌细胞的建系及分 析其遗传学特征是首先要做的工作。 1 材料与方法 1 . 1

5、 材料 肝癌组织取自一进行肝移植5 0岁男性肝癌患 者,肿瘤位于肝右叶,未转移,直径5c m,右肝门脉分 支充满癌栓,胞膜完整。术中取右肝主瘤和门脉癌栓 进行病理检查和细胞培养,病理诊断证实为原发性 肝细胞肝癌( HC C ) 。患者同时伴有门脉性肝硬化, 在肝移植手术同时进行了脾脏切除术,对于脾脏标 本一并进行细胞分离培养和液氮冻存。 1 . 2 主要试剂 0 . 1 %的胶原酶购自S i g ma公司, F 1 2培养液 购自G i b c o公司, P e r c o l l T M液购自P h a r ma c i a生物技 术 公司,无血清D ME M培养液购自G I B C OL公

6、司, 胎牛 血 清 购 自 Hy c l o n e公 司,人 表 皮 生 长 因 子 ( E G F )购自珠海东大生物制药有限公司, 2 5c m 2塑 料培养瓶购自美国C o r n i n g公司。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 细胞培养肿瘤组织经P B S冲洗后用眼科 剪剪成约1mm3大小,用0 . 1 %的胶原酶( S i g ma C h e mi c a l C o . , S t . L o u i s , MO)在3 7 下消化3 0分 钟,用孔径1 2 0目的不锈钢网过滤得细胞悬液。用不 含 血 清 的 F 1 2培 养 液( G i b c oB R L , G

7、 a i t h e r b u r g , MD ) 稀释细胞悬液,在4 下10 0 0r p m离心5分钟。 细胞团用培养液重新悬浮,铺在装有等渗梯度密度 P e r c o l l T M ( Ame r s h a mP h a r ma c i a B i o t e c h AB , Up p s a l a , S we d e n )的5 0ml离 心 塑 料 管 的 上 层, P e r c o l l梯度从底层 至 最 高 层 依 次 为7 0 %、 5 0 %、 4 0 %,每层5ml 。上层细胞悬液为5ml ,约含有2 . 0 1 0 7肿瘤细胞, 用台酚蓝染色证实9

8、0 %的细胞为 活细胞。在4 下45 0 0r p m离心3 0分钟,然后在 4 0 %层内吸取约3ml含细胞的P e r c o l l液,用F 1 2培 养液稀释5倍, 10 0 0r p m离心1 0分钟。沉淀细胞用 5ml F 1 2培养液洗涤3次。最后用含2 0 %胎牛血清、 1 0 g / L表皮生长因子( E G F ) 、 1 0 g / L转铁蛋白、 0 . 0 3 %谷氨酰胺、 1 0 0U/ ml青霉素和1 0 0 g / ml链 霉素的D ME M培养液悬浮。将5ml含1 1 0 6细胞 的培养液接种在2 5c m2塑料培养瓶,置3 7 、饱和 湿度的5 %C O2孵箱

9、培养。当细胞生长达7 0 %8 0 % 913 实用肿瘤杂志2 0 0 6年第2 1卷第4期 瓶底面积时传代。取自右肝主瘤组织的细胞培养不 成功,而取自门脉的转移瘤培养的癌细胞在体外维 持不断生长态势,命名为H4 M。 1 . 3 . 2 生长曲线培养第1 2代的H4 M细胞5 . 4 1 0 4接种于六孔板, 接种后第2天将细胞消化计数, 每天数3个平皿并计算平均值,连续7天,最后绘制 生长曲线和倍增时间。 1 . 3 . 3 细胞核型分析于培养的H4 M细胞中加入 0 . 3 g / ml的秋水仙素, 继续培养3小时,胰酶消化 收获细胞,经0 . 0 7mmo l / L氯化钾低渗处理3

10、0分 钟,于1 :3冰醋酸甲醇溶液固定2小时后滴片,所获 的中期分裂相染色体用标准胰酶-基姆萨( G带)分 带染色法染色。 1 . 3 . 4 对比基因组杂交( C G H)用蛋白酶K和十 二烷基硫酸钠消化培养的H4 M细胞,然后用酚氯仿 异戊醇抽提肿瘤细胞基因组D NA。取健康人周围血 淋巴细胞制备基因组D NA作正常参照。根据标准方 法先从健康男性淋巴细胞培养中获取中期分裂相染 色体。用缺口平移法分别将1 gH4 M基因组D NA 和性别相同 的 正 常 参 照 基 因 组 D NA标 记 绿 色- d UT P和红色- d UT P 。5 0 0n g标记H4 M细胞D NA 和 正常D

11、 NA探针变性后与正常中期相染色体在 3 7 湿盒中杂交4 8小时。用0 . 4 S S C / 0 . 3 %NP - 4 0 在7 5 洗涤玻片2分钟,室温下用2 S S C / 0 . 1 % NP - 4 0洗涤2分钟,然后用1 g / ml D AP I复染和用 抗褪色溶液封片。 1 . 3 . 5 数码图像分析经C G H杂交后的染色体用 由装有异染粒冷电荷照相机的Z e i s sAx i o p h o t显 微镜( Z e i s s , Ob e r k o c h e n , G e r ma n y )分析,每个中期 分裂相用轮转单色激发R h o d a mi n e

12、 、 F I T C和D AP I 滤 镜捕获三个图像。用Qu i p sC G H程序( Vy s i s , D o wn e r s G r o v e , I L )分析图像。每组样本共分析5个 中期分裂相,汇合从相同1 0条染色体所得的荧光数 据 计算平均比率。根据程序指引分析荧光比率, D NA序列拷贝数的增加和丢失分别以肿瘤细胞 D NA与参照D NA比率1 . 2 5或1 . 5 0时定为高拷贝数扩增。 1 . 3 . 6 周期素D 1基因的D N A - P C R检测( D P C R) 周期素D 1 ( c y c l i nD 1 )的基因称C C ND 1 ,位于1

13、1 号染色体 的1 1 q 1 3 。按 常 规 方 法 提 取 H4 M 细 胞 D NA,同时提取同一病例的正常肝组织、原发癌灶 和门脉内转移灶的组织D NA用于C C ND 1基因扩 增。所用引物序列为5 - AC CAG CT C CT G TG C T G C GAAGT G- 3 ,和5 - G ACG G CAG GAC CT C C T T CT G CAC A- 3 ,产物长度1 5 7b p 。P C R反应体 积 为 2 0 l ,内 含1 P C R缓 冲 液、 2 . 0mmo l / L Mg C l2、 5 0 mo l / Ld NT P 、 两条引物各0 .

14、5 mo l / L 、 4 l 模板D NA及1U T a qD NA聚合酶。P C R循环 参数为: 9 5 预变性5分钟,然后分别9 5 1分钟、 6 4 1分钟、 7 2 1分钟,共3 0个循环,最后7 2 延 伸8分钟。P C R扩增产物在1 2 %聚丙烯酰胺凝胶中 进行电泳,经银染显色后进行比较。由于多巴胺受体 基因( d o p a mi n e r e c e p t o r D 2 , D R D 2 )与C C ND 1基因 同位于1 1号染色体的长臂上( D R D 2在1 1 q 2 2 2 3 ) ,因此将之作为C C ND 1的内参照同时进行扩增, 以检测C C N

15、D 1是否真的扩增。所用引物序列为5 - T G AT G AT G AT C TG G AG AGG C AG AAC - 3 和5 - T G CC G AAG AC G AT G AC AGC G AT G A G- 3 , 产物长度为1 2 8b p 。最后将C C ND 1的扩增产 物含量与D R D 2进行比较,当C C ND 1扩增产物多于 D R D 2时视为有扩增。 1 . 3 . 7 裸鼠接种实验选用培养的第1 2代的H4 M 细胞和1 3只B AL B / C裸鼠,按照9 1 0 5细胞/ 只接 种于右臀皮下,接种后1个月,观察是否成瘤。 2 结果 2 . 1 细胞培养

16、H4 M肝癌细胞在第4代开始加速生长, 现已传 代6 0多代。形态学上H4 M细胞呈多角形,胞浆丰 富,核大,圆形,核仁多个而明显,可见核分裂和瘤巨 细胞。早期代数的H4 M细胞排列成索状,与肝小叶 排列相似,以后细胞呈单层片状生长,细胞紧密相 嵌,显示典型的恶性上皮细胞特征(图1 ) 。 图1培养的H4 M细胞形态( 4 0 0 ) 2 . 2 生长曲线 细胞第2天呈对数生长,第5天进入平台期,倍 增时间3 8小时(图2 ) 。 2 . 3 细胞遗传学 染色体G带显示H4 M细胞为超3倍体,其中有 023J o u r n a l o f P r a c t i c a l O n c o

17、l o g yV o l . 2 1 N o . 42 0 0 6 图2 H4 M细胞生长曲线 一 条 染 色 体 含 有 一 长 的 同 质 染 色 区 ( h o mo g e n e o u s l ys t a i n i n gr e g i o n , h s r ) 。 H4 M细胞核 型为7 1 - 7 8 , X X , +2 , d e r ( 2 ) t ( 2 ; 3 ) ( q 1 1 ; p 1 1 ) , a d d ( 5 ) ( p 1 5 ) , d e l ( 5 ) ( p 1 4 ) X 2 , I ( 5 ) ( p 1 0 ) , +6 , d e

18、 l ( 7 ) ( p 2 1 ) , i ( 7 ) ( p 1 0 ) , d e r ( 8 ) t ( 8 ; 9 ) ( q 1 1 ; q 1 1 ) , - 9 , a d d ( 1 1 ) ( q 2 5 ) , - 1 3 , + 1 5 , - 1 6 , d e l ( 1 6 ) ( p 1 1 . 2 ) , a d d ( 1 7 )( p 1 3 ) , d e l ( 1 7 )( p 1 1 .2 ) , - 1 9 , - 1 9 , - 2 0 , - 2 1 , - 2 2 , - Y, - Y, - Y, +8个标记染色体和1个h s r (图3

19、) 。 图3 H4 M细胞染色体分析 2 . 4 比较基因组杂交( C G H) C G H分析显示, H4 M的细胞遗传学改变( 图4 ) 为2 , 5 , 6 p , 7 p , 1 1 p , 1 3 q 2 1 . 3 - q t e r增加,而1 1 q 1 3为 高 拷 贝 数 扩 增, 8 p t e r - p 1 2 , 9 , 1 3 q 1 1 - q 2 1 . 2 , 1 6 q , 1 7 p t e r - p 1 2 . 1 9 p和X p t e r - q 1 3丢失。 图4中8号和1 1号染色体的C G H的染色结果。 线条图为1 0条相同染色体的C G

20、H荧光平均值比率 分析,其中中线为基线,比率为1 . 0 ,左线的比率为 0 . 7 5 ,右线为1 . 2 5 。曲线分别指示染色体8 p和1 1 q 1 3 的变化。 2 . 5 周期素D 1基因 D NA- P C R扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳,可见两条清晰的电泳带,分子量大小分别为1 5 7 b p ( C C ND 1 ) 和1 2 8b p ( D R D 2 ) 。 C C ND 1与D R D 2的 比值显示,正常肝组织未见C C ND 1扩增,而原发癌 灶和门脉内转移灶则有扩增, H4 M细胞的C C ND 1 基因有明显的扩增(图5 ) 。 图4 H4 M细胞染色体改

21、变的C G H分析 P : P r i ma r y ; M: Me t a s t a s i s ; N: No r ma l 图5 H4 M细胞周期素D 1基因电泳 2 . 6 裸鼠接种成瘤实验 所有接种的1 3只裸鼠,在接种后1个月均未见 肿瘤形成。 3 讨论 在体外建立肝癌细胞系是研究肝癌及其治疗方 法必不可少的重要手段,包括肝癌细胞在内的许多 肿瘤细胞的体外培养建株均非常困难 1 , 2 ,原发肿瘤 组织由于离体后环境变化,细胞往往会发生衰退死 亡,导致体外细胞建系的成功率极低。即使能在体外 生存,也常发生某些生物学特性改变或丢失 3 5 。本 实验中通过原代培养方法建立的一株肝癌

22、细胞系 H4 M, 采取常规消化方法传代,目前已传代6 0代。 经过对原代和传代的H4 M细胞形态分析、生长 特性研究表明该细胞具有恶性上皮细胞特征,传代 后生物学特性稳定。尽管这一细胞系尚未在裸鼠中 成瘤,但其遗传学改变为探明肿瘤浸润机制提供了 实验依据。细胞遗传学等研究发现该细胞系有如下 特征: ( 1 )染色体G带显示H4 M细胞为超3倍体,其 中有一条染色体含有一长的同质染色区。( 2 ) 1 1 q 1 3 等染色体高拷贝数扩增,而8 p等染色体部分丢失。 ( 3 ) C C ND 1基因有明显的扩增。 C C ND 1基因位于1 1 q 1 3 ,由3 5 1个腺嘌呤、 3 9 2

23、 个胞嘧啶、 3 7 6个鸟嘌呤和2 0 6个胸腺嘧啶组成,末 端有一个p o l yA(多聚腺苷酸)尾。 C y c l i nD 1蛋白含 123 实用肿瘤杂志2 0 0 6年第2 1卷第4期 2 9 5个氨基酸,由染色体1 1 q 1 3上的C C ND 1基因编 码。临床研究发现,约1 0 %的肝细胞癌中观察到 c y c l i nD 1基因扩增和蛋白浓度升高。多数恶性肿瘤 中均可发现该基因扩增,如胰腺癌、头颈部鳞癌、胶 质瘤、子宫颈癌等 6 9 。动物模型和细胞株实验表 明, c y c l i nD 1蛋白过度表达可使细胞G1期缩短,体 积变小,对分裂原的依赖性减弱,促进细胞周期

24、与细 胞增殖及肿瘤发生有关 1 0 , 1 1 。有学者研究HB V、 HC V病毒基因组与c y c l i nD 1间可能存在某种相互 作用,导致肝癌的发生。本组研究C C ND 1 ,将其视作 一个肿瘤抗原基因 1 2 1 4 ,研究该基因在R NA和蛋 白水平的表达情况,为进一步应用生物信息学研究 该基因编码的HL A- 类抗原肽奠定基础。 此外,成瘤实验成功受诸多因素影响,如裸鼠种 系、健康状况、性别、年龄等,肝癌细胞系本身特性、 细胞培养的条件、细胞的制备情况、细胞的活力亦有 可能影响成瘤实验结果 1 5 , 1 6 。总之, H4 M细胞系的 建立及研究结果证明,该细胞系生物学特

25、性稳定,为 肝癌临床治疗与基础研究提供了理想的模型,丰富 人肝癌细胞系的类型,有着非常重要的意义。 参考文献: 1 S i n gG K, P a c eR , R r i o r S , e t a l . E s t a b l i s h me n t o f ac e l l l i n ef r o m ah e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o maf r o m ap a t i e n t wi t hh e mo c h r o ma t o s i s J . He p a t o l o g y , 1 9 9 4 , 2 0 (

26、1 ) : 7 4 -8 1 . 2 Ma s a k i T, S h i mt o r i Y, R e n g i f oW, e ta l . He p a t o c e l l u l a rc a r c i n o mac e l lc y c l e : s t u d yo fL o n g - E v a n sc i n n a mo nr a t s J . He p a t o l o g y , 2 0 0 0 , 3 2 ( 4 ) : 7 1 1 -7 2 0 . 3 谢弘,沈鼎武.离体人体恶性肝肿瘤细胞的生物学特 性 A .汤钊猷.原发性肝癌 M .上海:科

27、学技术出版 社, 1 9 9 9 . 6 7 -6 9 . 4 刘军,王占民,刘博,等.人肝细胞癌细胞系HC C - 9 9 0 3的建立及其生物学特性研究 J .中华外科杂志, 2 0 0 1 , 3 9 ( 1 1 ) : 8 7 2 -8 7 4 . 5 胡川闽,刘彦仿,隋延仿,等.人肝癌细胞系HC C - 9 2 0 4 的建立及其特性研究 J .第四军医大学学报, 1 9 9 5 , 1 6 ( 2 ) : 9 2 -9 5 . 6 L i YJ , We i Z M, Me n gYX , e t a l . - c a t e n i nu p - r e g u l a t e

28、 s t h ee x p r e s s i o n o fc y c l i n D 1 , c - my ca n dMMP - 7i n h u ma np a n c r e a t i cc a n c e r :R e l a t i o n s h i pwi t h c a r c i n o g e n s i sa n dme t a s t a s i sJ . Wo r l dJ G a s t r o e n t e r o l , 2 0 0 5 , 1 1 ( 1 4 ) : 2 1 1 7 -2 1 2 3 . 7 Ma s u d aM, S u z u i

29、 M, Ya s u ma t i cR , e ta l . C o n s t i t u t i o n a c t i v a t i o n o fs i g n a lt r a n s d u c e r s a n d a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n 3 c o r r e l a t e s wi t h c y c l i n D 1 o v e r e x - p r e s s i o na n dma yp r o v i d ean o v e l p r o g n o s t i cma k e

30、 ri n h e a da n dn e c ks q u a mo u sc e l lc a r c i n o ma J . C a n c e r R e s , 2 0 0 2 , 6 2 ( 1 2 ) : 3 3 5 1 -3 3 5 5 . 8 S h i W, B a i B , Wa n gF R . C y c l i nD 1 / B c l - 1a n dp 2 7 / k i p 1 e x p r e s s i o ni ng l i o ma s , a n dt h e i rp o s s i b l ep r o g n o s t i c J .

31、C h i nMe dJ , 2 0 0 2 , 1 1 5 ( 3 ) : 4 4 -5 0 . 9 L uS ,Z h a n g B ,Wa n g Z .E x p r e s s i o n o fs u r v i v i n g , c y c l i nD 1 , p 2 1 ( WAF I ) , c a s p a s e - 3i nc e r v i c a lc a n c e r a n di t sr e l a t i o nwi t hp r o g n o s i s J . JHu a z h o n gUn i v S c i T e c h n o l

32、 o gMe dS c i , 2 0 0 5 , 2 5 ( 1 ) : 7 8 -8 1 . 1 0 Z h a n gYJ , C h e nS Y, C h e l aC J , e ta l . P o l y mo r p h i s ms i nc y c l i nD 1g e n ea n dh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o ma J . Mo l C a r c i n o g , 2 0 0 2 , 3 3 ( 2 ) : 1 2 5 -1 2 9 . 1 1 D o n n e l l a nR ,C h e t t y

33、R .C y c l i n D 1 a n d h u ma n n e o p l a s i a J . JC l i nP a t h o l : Mo l P a r t , 1 9 9 8 , 5 1 ( 1 ) : 1 -7 . 1 2 Ni s h i d aN, F u k u d aT, Ko me d aT, e t a l . Amp l i f i c a t i o n a n d o v e r e x p r e s s i o n o f t h e c y c l i n D 1 g e n e i n a g g r e s s i v e h u ma

34、n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o ma J . C a n c e rR e s , 1 9 9 4 , 5 4 ( 1 2 ) : 3 1 0 7 -3 1 1 0 . 1 3 Ar b e rN, D o k i Y, Ha nE K, e ta l . An t i s e n s et oc y c l i n D 1i n h i b i t st h eg r o wt ha n dt u mo r i g e n i c i t yo f h u ma n c o l o nc a n c e rc e l l s J . C

35、 a n c e rR e s , 1 9 9 7 , 5 7 ( 8 ) : 1 5 6 9 -1 5 7 4 . 1 4 Z h o uP , J i a n gW, Z h a n gYJ , e t a l . An t i s e n s eo f c y c l i n D 1 i n h i b i t sg r o wt h a n d r e v e r s e st h et r a n s f o r me d p h e n o t y p eo fh u ma ne x o p h a g e a lc a n c e rc e l l s J . On c o g e n e , 1 9 9 5 , 1 1 ( 3 ) : 5 7 1 -5 8 0 . 1 5 刘虎,叶胜龙,薛琼,等.大鼠肝癌自发肺转移裸 鼠 模型的建立 J .中华实验外科杂志, 2 0 0 4 , 2 1 ( 1 ) : 1 0 1 -1 0 2 . 1 6 程枫,钱关祥,陈诗书.提高人胃腺癌组织裸小鼠移 植瘤成功率的几种方法选择 J .上海实验动物科学, 2 0 0 1 , 2 1 ( 1 ) : 2 9 -3 2 . 223J o u r n a l o f P r a c t i c a l O n c o l o g yV o l . 2 1 N o . 42 0 0 6