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1、 6 1 0 伊强， 等 以合成肤为 抗原建立E LIS A试验检测鼻咽癌患者E B 病毒抗体的 研究 足 临床应用研究】 以合成肤为抗原建立 E US A试验检测 鼻咽癌患者 E B病毒抗体的研究 伊强， 王文华， 陈丹， 刘灿， 欧启水 福建医 科大学基因 诊断研究室福建医 科大学附属第一医院检验科， 福建福州3 5 0 0 0 5 E s t a b l i s h m e n t o f E L I S Am e t h o df o r d e t e c t i n gE B Va n t i b o d yb ys y n t h e t i cP e P t i d e YI
2、Q i a n g， WANGW云 n 一 Hua ， C HE ND a n ， L I UCan ， OUQ i 一 S h u 艺 L a b o rat o ryo fGen e D i a g n o s i s o fThe F uji a nM亡 d i c a l Uni *r s i t 少 ， D e P a r t m e n t o fC l i n 艺 c a l L a b o rat o 勺， F i r s t A ff i l 艺 a t e dHo s P 艺 t a l o fF 川i a n人 公d i c a l U 元 i versi t 夕， F
3、u zho u3 5 0 0 0 5 ， P . R . Ch i n a 【 摘要】 目的: 以人工合成肤为杭原基 质建立酶联免疫吸附试验， 检测 E B病 毒杭体。方法: 以人工合成肤作为杭 原， 建立 E L ISA试验， 并检浏 93 例弃 咽癌患者和 106 名正常人的血清。结 果: 以临界值 0 . 2 59 为阳性判断标准， 9 3 例弃咽癌患者血清中， 阳性 63 例， 敏感度为 6 7 . 7 %; 1 0 6名正常人血清 中， 阳性 8名， 特异度为 92. 5 %。结 论: 所建立的以合成肤为杭原基质的 E B病毒酶联免疫试验适用于鼻咽癌患 者的筛查。 中华肿瘤防治杂志，
4、 2 0 0 8 ， 1 5 ( 8 ) : 6 1 0 一6 1 1 A B S T R A C T O BJE C T I V E : T oe s t a b l i s ht h eE L I S Am e t h o db ys y n - t h e t i c P e p t i d e t o t e s t a n t i b o d y o f E p s t e i n- B a r r v i r u s ( E B V ) . ME T H O D S : B a s e do nt h e r e p o r t e da m i n oa c i ds e q u
5、 e n c e o f E B V ， o n e s y n t h e t i c p e p - t i d e w a s s y n t h e s i z e d b y s o l i d 一 p h a s e p e p t i d e s y n t h e s i s . T h e nt h e s y n t h e t - i c p e P t i d e w a s a p p 1 i e da s a na n t i g e nt od e t e c t t h e s p e c i f i cI g Aa n t i b o d y f r o ms
6、 e r u mi n9 3 N P Ca n dl o 6 n o r m a l h e a l t h y s u bj e c t s b y E L I S A . R E - S U L T S : T h e v a l u e o f o . 2 5 9 w a s s e l e c t e d a s t h e t h r e s h o l d v a l u e f o r p o s i - t i v e r e s u l t s . A m o n g9 3s e r af romN P Cp a t i e n t s ， 6 3w e r ep o s i
7、 t i v e ， t h e s e n s i t iv it y w a s 6 7 . 7 %， w h i l e 8 o f 1 o 6nor m a l s e r a w e r e p o s it i v e ， t h e s p e c i f i c i t y w a s 9 2 . 5 %. C O N C L U s l o N : T h i s E L I S Am e t h o du s i n g s y n - t h e t i c p e p t i d e a s a n t i g e nw a s s P e c i a l ， s e
8、n s i t i v ea n ds i m p l e ， i ss u i t a b l e f o r e a r l ys c r e e no f N P C . 班动J 么n 、e rP岸沙乃飞 舰 t ， 2 0 0 8 ， 1 5 ( 8 ) : 6 1 0 一6 1 1 【 关键词】 弃咽肿瘤/ 诊断; 鼻咽肿瘤/ 病毒学; 酶联免疫吸附测定; 杭体， 病毒/ 诊断应用 K E Y wo R D s n a s o p h a r y n g e a l n e o p l a s m s / d i a g n o s i s ; n a s o p h a r y n
9、 g e a l n e o p l a s m s / v i r o l o g y ; e n z y m e- l i n k e di m m u n o s o r - b e n t a s s a y ; a n t i b o d i e s ， v r i a l / d i a g n o s i s 中图分类号 R 7 3 9 . 6 3 文献标识码I A 文章编号】 1 6 7 3 一5 2 6 9 ( 2 0 0 8 ) 。 8 一0 6 1 0 一0 2 研究证明E B 病毒( e p s t e i n 一 b a r r v i r u s ， E B V )
10、 与鼻 咽 癌( n a s o p h a r y n g e a l c a r c i n o m a ， N P c ) 的 发生有密切 联系l。 血清流行病学调查表明， N P C确诊前患者血 清中已有高滴度的 E B V抗体， 所以检测血清中的 E B V抗体在N P C的早期诊断和防治上意义重大。通 常用作血清学试验的抗原， 主要为基因重组抗原和亲 和层析纯化的天然抗原 卜 4 。近年来， 人工合成多肤 由于克服了基因重组抗原制备复杂、 非特异结构多 以及与抗体反应的特异性较差等缺点， 已被广泛用于 多种病毒感染的检测5。 本研究利用噬菌体展示技术 筛选到的E B V蛋白 抗原的
11、优势表位6j， 采用固相法合 成了一条人工多肤， 并以此为抗原建立了E B V抗体的 固相酶联免疫测定方法， 结果报道如下。 【 基金项目1 福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目 资助( N C E T FJ一 0 6 0 7 ) 【 第一作者简介】 伊强， 男， 福建松澳人， 硕士， 主要从事临床 免疫学的研究工作。 T e l : 8 6 一5 9 1 一8 7 9 8 2 3 2 7 E-m a i l : y i q i a n g l 4 9 9 h o t ma i l c o m 【 通讯作者简介】 欧启水， 男， 福建南平人， 博士， 副教授， 硕士 生导师， 主要从事临床
12、免疲学的研究工作。 T e l : 8 6 一5 9 1 一8 7 9 8 2 3 2 6 E 一 ma i l : o u q i s h u i 1 6 3 . c o m 1 对象与方法 1 . 1 病例选择及一般资料 2 0 0 5 一 0 6 一 0 5 2 0 0 7 一 0 3 一 2 0 福建医科大学附属第一 医院收治的N P C患者 93例， 均经病理确诊。男 59 例， 女34例。年龄2563岁， 平均年龄46岁， 中位年 龄49岁。 来我院健康体检的正常人1 06名作为对照 组。 男6 0 名， 女4 6 名。年龄1 9 一5 0 岁， 平均年龄3 5 岁， 中位年龄40
13、岁。 1 . 2 主要试剂 合成肤抗原多肤由上海生工生物工程技术服务有 万方数据 中华肿瘤防治杂志 2 0 0 8 年 4 月第 15 卷第 8 期C H I NJ C A N C E RP R E VT R E A T ， A p r l l Z o o s ， V o l . 1 5 N o . 8 . 6 1 1 限公司合成， 合成后经 H P L C纯化， 纯度95%。并 进行M O D I 一 T O F质谱检测， 保证多肤序列正确。所 合成 的 E B V 多肤抗 原 氨基 酸序列为 S G L F E - HL A AH G R E F S K L S K， 命名为 E B 1
14、9 。H R P标记的 羊抗人 I g A及四甲基联苯胺均为 S i g m a 公司产品。 包被液、 封闭液、 洗液、 稀释液和终止液等同常规 E L I S A ， 。聚苯乙烯酶标板为美国C o s t a r 产品， 6 8 0 型酶标仪为B I O 一 R A D公司产品。 1 . 3 E U S A检测方法 以合成肤作为包被抗原， 采用棋盘滴定法8j确定 最适包被抗原浓度和血清稀释度。通过改变反应条 件， 筛选出最佳包被液、 最佳封闭液、 最佳洗涤液、 最佳 稀释液以及各个步骤所需的反应时间和反应温度。建 立 E LIS A标准化操作程序。优化反应条件中所用到 的混合阳性血清为已确诊
15、为N P C患者的血清混合而 成， 混合阴性血清则为正常人的血清混合而成。 2 结果 2 . 1 多肤抗原包被液选择 分别用 p H g . 6C BS、 p H 7 . 4P BS 和 p H S . oTris - H CI为包被液， 以等量抗原包被酶标板， 在相同条件下 测定混合阳性血清和混合阴性血清O D ， 5 。 值， 观察 3 种 包被液的效果。用p H g . 6 C BS 作为包被液， 混合阳性血 清O D 5 。 值高且混合阴性血清 0 玖5 。 值低， 故采用 p H g . 6 C BS 作为包被液( 表1 ) 。 值和P / N值， 结果表明以37 包被 Zh 后再
16、4包 被24h 为最佳。 2 . 4 封闭液选择 将未包被抗原的酶标板， 分别用含1 %和5 %E S A 的P BS、 含5 %小牛血清的P BS 和含2 %明胶的P BS 封 闭， 37 作用3 h ， 加一抗和二抗， 终止后读取0 玖5 。 值， 取混合阳性血清0 玖5 。 值最低的为最佳封闭液。结果表 明用含5 %BSA的P BS 作封闭液为最佳。 2 . 5 样品和酶稀释液的选择 分别用P B S T 、 含5 %小牛血清的P B S T及含1 % B S A的P B S T作为稀释液稀释血清， 比较混合阴性和 阳性血清的O D ; 5 。 值和P / N值， 本研究选择 P B S
17、 T作 为稀释液。 2 . 6 反应时间的选择 按照阳性 O D 45 。 接近 1 ， P / N值最大的原则， 对血 清反应时间、 酶标二抗的作用时间及底物显色时间进 行优化。最终将血清与包被的酶标板作用时间定为 l h ， 酶标二抗的作用时间定为45 m in， 底物显色时间 定为Z o m i n 。 2 . 7 间接E U S A方法阴阳性临界值的确定 按照已建立的间接E LIS A方法检测35份阴性血 清， 每份血清重复 2孔， 计算 0 D 4 5 。 的平均值及标准 差。经计算阴性血清O D45 。 的平均值为0 . 151 ， 标准方 差为 0 . 0 3 6 ， 所以阳性临
18、界值为 0 . 259 ， 即在对照成立 的情况下， ( 卫 天 5 。 0 . 2 59就可以判为阳性， 否则为阴性。 表 1 不同包被液对检测结果的影响 阴阳性临界值=阴 性血清0 玖5 。 的平均值+3 X 标准差 组别 P Hg . 6 C B S 包被液 P H7 . 4 P B SP HS . O T r i s- HC L 阳性血清 O D值 阴性血清 O D值 1 . 2 9 2 0 1 8 3 1 . 2 5 0 0 . 1 8 7 1 。 2 3 6 0 . 1 8 9 2 . 2 多肤抗原最适包被浓度和待检血清稀释度的确定 用包被缓冲液将多肤抗原稀释成40. 0 00、
19、20. 0 00、 1 5 . 0 0 0 、 1 0 . 0 0 0 、 7 .5 0 0 、 5 . 0 0 0 、 2 .5 0 0 、 1 . 2 5 0 、 0 . 6 2 5 、 0.25 0 和0.1 25拜 9 / m L 等不同浓度包被反应板。 混合 阳 性血清和混合阴性血清分别作原液、 1 ， 10、 1 ， 20、 1 2 5 、 1 ， 5 0 、 1 1 0 0 和1 ， 2 0 0 稀释， 与合成多肤不同 稀释度组成方阵1 00拌 L/孔， 相同浓度设一个重复， 按常 规进行E LIS A测定。比较阴性和阳性血清的O D 魂 5 。 值， 选择阳性0 玖5 。 接近
20、1 ， P / N值最大时抗原的稀释度为 抗原包被的最佳浓度， 相对应的血清稀释度为最佳血清 稀释度。 结果表明包被浓度和待检血清稀释度分别以 10拌 9 / m L 和1 ， 20稀释为最佳。 2 . 3 包被温度和时间的选择 选用4包被 24 h 、 37 包被 4h和37 包被 Z h 后再4 包被24 h 等3 种不同的包被条件， 按常 规进行 E LIS A测定。比较阴性和阳性血清的 0 D 450 2 . 8 重复性 取1 份中强阳性样品同一酶标板测定20孔， 其批 内变异系数为 8 . “%; 取 1 份中强阳性样品， 分批做 2 。 次测定， 结果批间变异系数为10. 39%。
21、 2 . 9 血清标本测定 93 例 N P C患者与 1 06 名正常人血清， 检测 E B 1 9 / I g A， 并与V C A /I g A作比较， 结果检测E B19 /I g A 的敏感度为67. 7 %， 特异度为92. 5 %( 表2)。 表Z E L Is A 检测E 日 1 9 / 19 的结果 n ( %) 组别 E B 1 9 / I g AV C A / I g A 一十 一 N P C患者 正常人 g3 1 06 6 3 ( 6 7 . 7 ) 8 ( 7 . 5 ) 3 0 ( 3 2 . 3 ) 9 8 ( 9 2 . 5 ) 9 0 ( 9 6 . 8 )
22、1 9 ( 1 7 . 9 ) 3 ( 3 . 2 ) 8 7 ( 8 2 。 1 ) 3 讨论 E B V是一种普遍存在于人类的疤疹病毒， 人感染 后形成终身潜伏性感染。E B V至少编码60种病毒蛋 白， 病毒组分复杂， 筛选合适的病毒蛋白组分作为血清 学试验的抗原基质对提高试剂盒的灵敏 ( 下 转第6 2 1 页 ) 万方数据 张曦 彤， 等 三遭逻鱼卫巡遨 微球栓塞鼻咽和鼻窦纤维血管瘤疗效的观察 外科手术切除 11。 本研究认为， 丙烯酸微球颗粒直径 较小， 且均匀一致， 栓塞前浸在造影剂中体积不会膨 大， 更易通过微导管注入， 因此可保证其血管远端的栓 塞水平， 使栓塞范围更充分，
23、肿瘤更易坏死和缩小， 比 明胶海绵、 P V A颗粒和钢圈辅助栓塞法能达到更好的 治疗效果。 栓塞治疗可能发生的严重并发症包括脑梗塞、 偏 瘫、 失明、 面神经麻痹及颜面部皮肤组织坏死等。为降 低严重并发症的发生， 本研究认为以下几点防治经验 非常重要: 1)操作者对头颈部血管的解剖知识的掌握 和熟练的介人手术操作。操作者应能在血管造影下仔 细地辨认肿瘤的责任供血血管， 避免误栓。对介入器 材的操作要快、 轻、 准， 防止由于操纵而导致的血管痉 挛和急性血栓形成。2)提倡采用微导管进行栓塞治 疗。微导管的使用更容易控制好栓塞的水平， 防止血 管痉挛， 有效地避开重要和危险的血管支。3)注射栓
24、塞物时， 切记不要过猛和过快， 以防止栓塞物的返流和 由于加压注射而可能引起的危险吻合支的开放。4)介 人治疗中， 还应充分采用血管造影机的软件功能， 如图 像放大、 路径图和参考图像对比等方式， 则更有助于提 高栓塞治疗的成功率。 总之， 作为一种新型的栓塞材料， 三经甲基一 丙烯 酸微球可安全地用于鼻咽及副鼻窦纤维血管瘤的栓塞 治疗， 栓塞后可有效缩小肿瘤， 利于手术切除。 【 参考文献】 1 Z s a d r i M， M id w i n t e r K ， A h m e d A ， e t a l . A s s e s s m e n t o f s a f e t y a n
25、 de f f ic a c y o f a r t e r i a l e m b o l i s a t io n i n t h e m a n a g e m e n t o f in t r a c - t a b l e e p i s t a x i s J . E u r r c h o t o r h in o l a r y n g o l ， 2 0 0 6 ， 2 6 3 ( 2 ) ; 5 6 0 一5 6 6 . 2 P e t r u s o nK ， R o d y iq u e z 一 C a t a r i n oM， P e t r u s o n B ，
26、 e t a l . J u v e n i l e n a s o p h a r y n g e a l a n g io f i b r o m a : l o n gt e r mr e s u l t s inp r e o p e r a t i v e e mb o l i z e da n d 2 0 0 2 ， 1 2 2 ( 1 ) : n o ne m b o l i z e dp a t i e n t s J .A c t ao t o l a r y n g o l ， 9 6 一 1 0 0 . 3 林刃舆， 余超， 陈建福， 等. 经导管领内动脉栓塞在鼻咽纤维血
27、管 瘤治疗中的临床价值 月.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志， 2 0 0 6 ， 1 4 ( 2 ) : 8 6 一8 8 . 范新东， 石润杰， 王德辉， 等. 青少年鼻咽纤维血管瘤的辅助性介 人治疗 J .中华放射学杂志， 2 0 0 6 ， 4 0 ( 1 1 ) : 1 1 9 7 一1 1 9 9 . 朱文科， 单鸿， 朱康顺， 等. 鼻咽纤维血管瘤术前上领动脉栓塞的 临床价值 J . 介入放射学杂志， 2 0 0 4 ， 1 3 ( 5 ) : 4 1 4 一4 1 6 . 孟昭明， 张政华. 鼻咽纤维血管瘤术前供血动脉栓塞的临床价值 探讨 J .中国医学影像技术， 2 0 0 2
28、， 1 8 ( 6 ) : 5 5 1 一5 5 3 . 门JlesJ 连哎口 一ILllL 6 收稿日期: 2 0 0 8 一0 1 一3 0 修回日期: 2 0 0 8 一0 3 一1 5 ( 编辑: 王秀华) 、公户，户户、 夕 户、 目 户、 汐 户户、 ， 户， 奋 户 产、 ，户、 户、 户、 户沪、 公户、 奋奋 产产勺 户、 户 户、 夕 户、 ， 户味 岁 户 产产产、 公户户 告 户、 公户、 奋 户、 浴 户嚼 ， 每 户协产、 产产， 户户产户、 奋小心产产户， 奋 户兮 百 户 产 上 接第61 1 页 ) 度和特异性十分重要， 也是近几十年来 N P C实验诊断研究
29、领域的难点和热点。目前， 测定 E B V抗体所用抗原主要为基因重组抗原， 这种抗原通 常用大肠埃希菌来制备， 因此难免会带有大肠埃希菌 本身的蛋白而影响结果。而人工合成多肤抗原没有细 菌蛋白混杂， 且相对分子质量小， 结构简单， 从而避免 了交叉反应的可能， 使结果的准确性得到了提高。本 研究根据噬菌体展示技术筛选到的E B V蛋白抗原的 优势表位， 合成了一条多肤， 以此为抗原建立了E B V 抗体的E L ISA检测方法， 以临界值 0 . 2 59 为阳性判断 标准， 检测 N P C患者血清和正常人血清， 敏感度为 6 7 . 7 %， 特异度为92. 5 %， 与检测V C A /
30、 I g A相比敏感 度低于V C A /lg A， 特异度则高于V C A /Ig A。提示可 以将E B 1 9 / I g A和V C A /I g A进行联合检测， 以提高 N P C诊断的敏感度并减少漏检率。 F e n gP ， C h a nSH， SooMY ， e t a l .A n t i b o d yr e s p o n s et oE p - s t e i n 一 B a r r v i r u s R t a p r o t e i ni np a t i e n t s w i t hn a s o P h a r y n g e a l c a r c i
31、 - n o m a : a n e w， e r o l o g i c p a r a m e t e r f o r d i a g n o s i s J . C a n c e r ， 2 0 0 1 ， 9 2 ( 7 ) : 1 8 7 2 . C h e nM R，L i uM Y，Hs uSM，e t a l .Us eo f b a c t e r i a l l ye x - p r e s s e d E B N A-l p r o t e i nc l o n e df r o ma n a s o p h a r y n g e a l c a r c i n o
32、m a ( N P C) b i o p s y a s a s c r e e n in g t e s t f o r N P Cp a t i e n t s J ， JM e d Vi r o l ，2 0 0 1 ， 6 4 ( 1 ) : 5 1 . 李泽卿， 田勇泉， 肖健云， 等. E B病毒特异性 D N A酶的纯化制备 J . 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志， 2 O 00， 6 ( 1 ) : 2 8. G o m a r a MJ ， H a rol . S y n t h e t i c p e p t id e s fo r t h e i m m u n o d i a
33、 g n o s i s o f h u m a n d i s e a s e s J . C u r r Me d C h e m， 2 0 0 7 ， 1 4 ( 5 ) : 5 3 1 . 张颖， 肖 锡宾， 张昌卿， 等. 鼻咽癌患者血清抗体相关抗原优势表 位的筛选 J . 癌症， 2 0 0 4 ， 2 3 ( 9 ) : 9 9 9 . 朱立平， 陈学清. 免疫学常用实验方法 M . 北京: 人民军医出版 社， 2 0 0 0 : 3 5 2 . J o h nR ， C row t h e r .T h eE L I S Ag u i d e b o o k M .T o t o w a ， NJ : Hu ma n aP r e s s ，2 0 0 1 : 9 3 . IJ一esJ 4llJ 一.LrL 门J勺J一|习 月Ot了一K 一ILFL厂L 【 参考文献】 1 宗永生， 张锦霞， 陈国雄， 等. 中国南方鼻咽鳞状细胞庙与E B 病毒 感染的关系 J . 癌症， 1 9 9 9 ， 1 8 ( 1 ) : 9 . 收稿日期: 2 0 0 8 一0 1 一2 5 修回日期: 2 0 0 8 一0 3 一3 0 ( 编辑: 马骏) 万方数据