体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为胰岛样细胞的研究.pdf

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1、基础论著 体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为 胰岛样细胞的研究 孙吉平 贾延劼 宋建辉 罗芳 杨于嘉 【 摘要】 目的 探索大鼠骨髓间质干细胞(M S C s) 体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法, 为解 决胰岛移植物来源匮乏问题提供新的思路。 方法 采用横向分化技术, 将成年大鼠M S C s诱导成 胰岛素分泌细胞; 间接免疫荧光法鉴定诱导前后的细胞巢蛋白、 胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素的表 达;R T - P C R法检测诱导前后的细胞胰岛素- 1、P d x - 1、P a x - 6mR NA的表达;2 4h累积分泌量测定和 胰岛素刺激实验评价诱导前后细胞的功能。 结果 诱导5h,

2、巢蛋白阳性细胞为(4 4. 67. 3)%, 诱 导2 4h增至(6 1. 88. 4)%。此后, 巢蛋白阳性细胞数开始下降, 诱导第1 4天后, 巢蛋白表达基本消 失。而且, 诱导后细胞可表达胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素等蛋白; 表达胰岛素- 1及其多种转录因 子基因mR NA; 胰岛素刺激实验反应敏感, 而诱导前M S C s不具备上述特点。 结论 体外大鼠 M S C s可诱导成为胰岛素分泌细胞, 为胰岛移植开辟新的研究思路。 【 关键词】 干细胞, 骨髓; 胰岛; 分化 R a tb o n em a r r o wm e s e n c h y m a l s t e mc e

3、l l s a r e i n d u c e d t od i f f e r e n t i a t e i n t o i s l e t - l i k i n g c e l l s i nv i t r o S UN J i - p i n g*,J I AY a n - j i e,S ONGJ i a n - h u i, e ta l.D e p a r t m e n to f P e d i a t r i c s,X i a n g y a H o s p i t a l, C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y,C h a

4、 n g s h a 4 1 0 0 0 8,C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:J I AY a n - j i e,E - m a i l:j i a y a n j i e 2 0 0 2y a h o o.c o m.c n 【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T o i n d u c eb o n em a r r o w m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s(M S C s)t od i f f e r e n t i a t e i n t oi

5、 n s u l i n - s e c r e t i n gc e l l si nv i t r o . M e t h o d s U s i n gad e f i n e dc u l t u r em e d i u ma n dt e c h n i q u ef o r t r a n s d i f f e r e n t i a t i o n,M S C s f r o ma d u l t S Dr a t sw e r eg u i d e d i n t os p e c i f i c i n s u l i n - s e c r e t i n gc e l

6、 l s . T h e e x - p r e s s i o n so f i s l e t - s p e c i f i ch o r m o n e s a n dp r o t e i n s,s u c ha s i n s u l i n,g l u c a g o n s a n ds o m a t o s t a t i nw e r ed e - t e c t e da n da n a l y z e db y i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c ec y t o c h e m i s t r ys

7、t a i n i n gb e f o r ea n da f t e r t h e i n d u c - t i o n . A n d i n s u l i n1,P d x - 1a n dP a x - 6w e r ed e t e c t e db yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - P C R(R T - P C R). I na d d i - t i o n,i n s u l i ns e c r e t i o nw a se x a m i n e du s i n gr a d i o i mm u n o a

8、 s s a y . R e s u l t s T h ed i f f e r e n t i a t e d M S C s w h i c he x p r e s s e dn e s t i nw e r e4 4 . 67 . 3% a f t e r5hi n d u c t i o n,6 . 1 88 . 4% a f t e r2 4hi n d u c t i o na n d d i s a p p e a r e da t 1 4d a yc u l t u r e .M e a n t i m e,t h ed i f f e r e n t i a t e dc

9、 e l l sh a dp o s i t i v e i mm u n o r e a c t i v i t yt oi n - s u l i n,g l u c a g o na n ds o m a t o s t a t i n,a n de x p r e s s e di n s u l i n1,P d x - 1,P a x - 6mR NA.T h ed i f f e r e n t i a t e d c e l l sw e r e a b l e t op r o d u c eh i g h e r l e v e l i n s u l i n,a n dd

10、 i s p l a y e dg l u c o s e - d e p e n d e n t i n s u l i nr e l e a s e i nv i t r o . C o n c l u s i o n A d u l t r a tM S C sc a nb e i n d u c e dt od i f f e r e n t i a t e i n t o i n s u l i n - s e c r e t i n gc e l l s i nv i t r o . 【K e yw o r d s】 S t e mc e l l s,m y e l o i d;I

11、 s l e to fL a n g e r h a n s;D i f f e r e n t i a t i o n 胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效方法之一, 但移植物数量和质量、 免疫排斥以及伦理学等诸多 问题 限 制 了 该 项 技 术 的 发 展。骨 髓 间 质 干 细 胞 (MS C s) 具有多向分化潜能, 可以诱导分化为多类 细胞 1。本研究采用横向分化技术, 将大鼠 MS C s 诱导分化为胰岛素分泌细胞, 为干细胞移植研究奠 定基础。 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(3 0 2 0 0 1 2 8) 作者单位:4 1 0 0 0 8 长沙, 中南大学湘雅医学院附属湘雅

12、医院儿 科( 第一作者现在南京军区南京总医院肾脏病研究所工作,2 1 0 0 0 2) 通讯作者: 贾延劼,E - m a i l: j i a y a n j i e2 0 0 2y a h o o . c o m. c n 材料与方法 一、 主要试剂 DMEM,B2 7,T r i z o l, 胎牛血清,L Y 2 9 4 0 0 2, 碱性 成纤维生长因子( b F G F) , 肝细胞生长因子(HG F) , M a t r i g e l, 胰岛素放射免疫试剂盒,R T - P C R试剂 盒; 小鼠抗大鼠巢蛋白抗体, 小鼠抗大鼠胰岛素、 胰 高血糖素、 生长抑素抗体, 山羊抗大鼠

13、P d x - 1抗体, 各种荧光标记的二抗。 二、 大鼠MS C s分离、 培养和扩增 参照参考文献 2 , 细胞传1 0代后行诱导实验。 621 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 三、 体外诱导MS C s分化为胰岛素分泌细胞 分为3个阶段: 诱导MS C s分化为巢蛋白阳性 细胞(DMEM培养基+5mm o l/L2 -巯基乙醇培养 5h) ; 诱导巢蛋白阳性细胞扩增并分化为前体细胞 ( 细胞接种于涂有M a t r i g e l的培养板, 在DM EM培养

14、基+B 2 7+1 0g /Lb F G F+0 . 1mm o l/L2 -巯基乙醇 + I T S中 培 养7天) ; 诱 导 胰 岛 素 分 泌 细 胞 成 熟 (DM EM培养基+B 2 7+1 0g /L HG F+2 0mm o l/L 烟酰胺+0 . 1mm o l/L2 -巯基乙醇+L Y 2 9 4 0 0 2培养 7 2 1天。 四、 诱导后细胞形态、 功能鉴定 1.间接免疫荧光鉴定诱导前后的细胞: 细胞固 定后常规加入一抗4过夜; 再加入相应的荧光标 记的二抗, 终止反应后荧光显微镜下观察。阴性对 照将一抗换用P B S, 其余步骤相同。 2. R T - P C R方

15、法:T r i z o l试 剂 提 取 细 胞 总 R NA, 紫外分光光度计对R NA样品定量后通过 R T - P C R进行产物扩增, 琼脂糖凝胶电泳检测。 3.收集2 4h培养基, 以放射免疫法测定胰岛素 累积分泌量。 4.胰岛素刺激实验: 参照参考文献3 , 计算刺 激指数( S I) 。 五、 统计学分析 采用方差分析和x 2 检验, 应用S P S S1 0. 5统计 软件完成统计分析。 结果 一、 巢蛋白阳性细胞鉴定 第一阶段诱导5h, ( 4 4 . 67 . 3)%巢蛋白阳性 细胞表达。第二阶段诱导2 4h, 巢蛋白阳性细胞增 至( 6 1 . 88 . 4)%,4 8h

16、巢蛋白阳性细胞降至(3 8 . 1 7 . 7)%; 第三阶段诱导第1 4h, 巢蛋白阳性细胞 表达基本消失。( 图1) 二、 诱导后细胞鉴定 1 .间接免疫荧光法: 诱导前MS C s不表达胰岛 各细胞的标记物。诱导第1 4天, 在细胞团状结构中 央出现大量的胰岛素阳性细胞, 同时胰高血糖素、 生 长抑素阳性细胞数目增多, 高于诱导第7天的表达。 ( 图24) 2 . R T - P C R: 诱导第2 8天, 胰岛素- 1、P d x - 1、P a x - 6 m R N A表达显著高于第7天和第1 4天( 图5) 。 3 . 2 4h累积分泌量: 诱导7天后, 胰岛素分泌 量急剧增加,

17、 而且随着时间延长分泌量呈上升趋势, 各时间点相比, 差异均有统计学意义( P0. 0 1) 。 4.胰岛素刺激实验: 诱导第7天, 细胞对葡萄糖 的刺激可以产生反应; 诱导第1 42 8天细胞的基础 和刺激后分泌量均显著增高, 对葡萄糖的刺激更加 敏感; 第1 4天、 第2 8天的S I较第7天显著升高(P =0. 0 0 0 8、0. 0 0 3) , 但是第1 4天与第2 8天相比, 差 异无统计学意义( P=0. 0 5 1) 。( 图6) 721 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o

18、 l 1 4,N o2 图5 R T - P C R检测结果 F i g5 T h eR T - P C Rd e t e c t i o nr e s u l t s 图6 胰岛素刺激实验 F i g6 T h e i n s u l i n - s t i m u l a t i n gt e s t 讨论 研究表明, 胚胎干细胞和成体干细胞都可以诱 导分化为胰岛素分泌细胞 4。但是以胚胎干细胞分 化的胰岛作为移植物, 仍然需要面临免疫排斥的难 题。而源于成体干细胞分化的胰岛有可能避免这个 问题。成体干细胞来源广泛, 本研究采用MS C s作 为诱导细胞, 主要原因是这种细胞取材简单方便,

19、 体 外易于扩增, 培养方法较胚胎干细胞或其他成体干 细胞简单, 易于基因修饰等优点。 选择合理的诱导策略是MS C s诱导成败的关 键。本研究将整个诱导过程分为三个阶段, 在不同 的阶段建立不同的诱导微环境。 第一阶段是诱导 MS C s成为巢蛋白阳性细胞, 在无血清培养基中加 入巯基乙醇、 诱导56h后可观察到巢蛋白的表 达。第二阶段包括巢蛋白阳性细胞扩增和胰岛前体 细胞形成两个部分, 由于彼此连续、 重叠, 诱导微环 境相同, 所以没有进一步区分。这一阶段加入b F - G F等生长因子以促进胰岛形成, 提高诱导效率 5。 此外, 采用细胞外基质M a t r i g e l促进胰腺导管

20、组织 分化为胰岛结构, 而且有利于建立合理的胰岛立体 空间结构 5。第三阶段的特点是b F G F等生长因子 的撤离。撤离后胰岛素分泌量急剧增加, 提示这一 阶段细胞迅速分化成熟。同时, 许多细胞很快形态 改变、 脱落。因此, 本研究采用细胞外基质M a t r i g e l 以增加贴壁细胞数目, 延长诱导时间;L Y 2 9 4 0 0 2和 HG F促进胰岛素分泌细胞的成熟, 增加胰岛素分泌 量 5,6。 胰岛是多细胞组成的集合体, 从单一的MS C s 诱导分化成为细胞的组成、 空间排列与胰岛完全一 致的难度较大。虽然本研究诱导的胰岛素分泌细胞 形态上与真正的胰岛有一定的差别, 仅是能

21、够表达 P d x 1、P a x 6等参与胰岛素分泌调节的基因, 而且可 释放一定量的胰岛素, 对葡萄糖刺激有一定的反应 性, 具备了替代胰岛移植物的潜能。 参考文献 1 B i a n c oP,R i m i n u c c iM,G r o n t h o sS,e t a l . B o n em a r r o ws t r o m a l c e l l:n a t u r e,b i o l o g y,a n d p o t e n t i a la p p l i c a t i o n.S t e m C e l l, 2 0 0 1,1 9:1 8 0 - 1 9 2.

22、 2 贾延劼, 杨于嘉, 周燕, 等. 黄芩甙诱导骨髓基质细胞向神经细胞 分化的研究.中华医学杂志,2 0 0 2,8 2:1 3 3 7 - 1 3 4 1. 3 贾延劼, 杨于嘉, 刘玲, 等.胰岛与S e r t o l i细胞体外共同培养. 中 华内分泌代谢杂志,2 0 0 2,1 8:1 4 8 - 1 5 1. 4 L u m e l s k yN,B l o n d e lO,L a e n gP,e ta l .D i f f e r e n t i a t i o no fe m - b r y o n i cs t e mc e l l st oi n s u l i n

23、- s e c r e t i n gs t r u c t u r e ss i m i l a rt op a n - c r e a t i c i s l e t s . S c i e n c e,2 0 0 1,2 9 2:1 3 8 9 - 1 3 9 4. 5 S c h u l d i n e r M,Y a n u k aO,I t s k o v i t z - E l d o rJ,e ta l .E f f e c t so f e i g h tg r o w t hf a c t o r so nt h ed i f f e r e n t i a t i o n

24、o fc e l l sd e r i v e df r o m h u m a ne m b r y o n i cs t e mc e l l s .P r o cN a t lA c a dS c iU S A,2 0 0 0, 9 7:1 1 3 0 7 - 1 1 3 1 2. 6 H o r iY,R u l i f s o nI C,T s a iB C,e t a l . G r o w t h i n h i b i t o r sp r o m o t e d i f f e r e n t i a t i o no fi n s u l i n - p r o d u c i n gt i s s u ef r o me m b r y o n i cs t e m c e l l s . P r o cN a t lA c a dS c iU S A,2 0 0 2,9 9:1 6 1 0 5 - 1 6 1 1 0. ( 收稿日期:2 0 0 4 - 0 9 - 0 3) 821 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2