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1、1： 对照组 2 7： ICP 组 图 2 ICP 组患者 MDR3 基因外显子 PCR-SSCP 分析结果 白。MDR3 蛋白含有两个三磷酸腺苷结合域和两个跨膜域， 分布在肝脏毛细胆管膜， 作为磷脂载体促进胆汁分泌， 与胆 汁酸形成微胶粒， 保护胆管不受疏水性胆汁酸引起的损害。 越来越多的证据表明， 该基因与 ICP 的发生有密切关系。 ICP 患者 MDR3 基因突变多分布于编码 MDR3 蛋白的三磷 酸腺苷结合域或跨膜域的外显子， 引起 MDR3 能量供应或底 物特异性异常； 由于这些 ICP 患者均为杂合子， 非孕期正常 等位基因的表达掩盖了这些突变对 MDR3 蛋白的影响， 因 此，
2、 这种杂合状态代表了部分妇女 ICP 的遗传易感性 2。 研究表明， MDR2 基因 （MDR3 的鼠类同源基因） 启动子 含有一个固醇反应元件， 可影响 MDR2 基因转录水平的调 控 3；激素可直接作用于 MDR3 蛋白， 影响其功能4。当妊 娠产生大量性激素和 （或） 环境因素影响时， 非遗传因素通 过减少杂合子正常等位基因的表达， 调整毛细胆管膜 MDR3 蛋白的表达； 同时妊娠期母体肝脏负担加重， 导致轻度肝功 能和毛细胆管功能不良， 出现胆汁淤积， 从而引起 ICP 2。 熊去氧胆酸可上调原代培养肝细胞MDR2蛋白的表达 3， 也可促进 ICP 患者 MDR3 蛋白的表达， 这为熊
3、去氧胆酸治疗 ICP 提供了理论依据。 采用 PCR-SSCP 方法， 本研究未能在 MDR3 基因突变集 中的 5 个外显子中寻找出新的突变， 可能与以下因素有关： （1）MDR3 突变频率与研究人群中 -GT 升高者的构成比有 关 2。 （2）现有检测方法低估了编码区或绞链区的突变。 （3） 其他部位包括拼接区及启动子的突变和 （或） 变异也可 能影响基因表达 5。 参考文献 1戴钟英 . 妊娠期肝内胆汁淤积症. 见： 曹泽毅， 主编. 中华妇产 科学 . 第 2 版 . 北京：人民卫生出版社， 2004. 468-475. 2Gendrot C，Bacq Y，Brechot MC，et
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5、Hepatology，2000， 32： 341-347. 4Smith AJ， van Helvoort A， van Meer G， et al.MDR3P- glycoprotein，a phosphatidylcholine translocase，transports several cytotoxic drugs and directly interacts with drugs as judged by interference with nucleotide trapping.J Biol Chem，2000， 275： 23530-23539. 5Pauli-Magnus C
6、，Lang T，Meier Y， et al. Sequence analysis of bile salt export pump（ABCB11）and multidrug resistance p-glycoprotein 3（ ABCB4，MDR3）in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy. Pharmacogenetics， 2004， 14： 91-102. （收稿日期： 2005-05-25） （本文编辑： 潘伟） 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30470703， 30270512） ； 山东省优秀中青年
7、科学家奖励基金资助项目 （01-BS54） 作者单位： 250021 济南， 山东大学山东省立医院生殖医学中心 曹义娟 （现在徐州市中心医院妇产科 221009） 通信作者： 陈子江 （Email： sdliyuan hotmail. com） 体外成熟对卵母细胞纺锤体及染色体形态的影响 曹义娟 李媛 陈子江 马水英 姜晶晶 以往的研究发现， 未成熟卵母细胞体外成熟培养及体外 受精-胚胎移植后着床率低的原因之一， 可能是体外成熟的 卵母细胞纺锤体和染色体排列发生了异常， 引起胚胎发育潜 能降低 1。本研究通过观察未成熟卵母细胞体外成熟培养 后， 卵母细胞纺锤体与染色体的变化， 探讨体外成熟培养
8、对 卵母细胞纺锤体与染色体的影响。 一、 对象与方法 1. 卵母细胞的获取和培养：（1） 未成熟卵母细胞的获取 和体外成熟培养： 未成熟卵母细胞来源于 2003 年 1 6 月 就诊于山东省立医院生殖医学中心的 37 例多囊卵巢综合征 患者。患者年龄 25 32 岁， 平均 （28. 1 2. 3） 岁。37 例患 者在未刺激周期进行未成熟卵泡穿刺治疗， 即在人工周期第 10 12 天， 超声监测双侧卵巢无直径8 mm 的卵泡， 当晚 给予人绒毛膜促性腺激素 （hCG）10 000 U， 肌内注射， 36 h 后取卵母细胞。将取出的未成熟卵母细胞放入含有 20% 胎 牛血清、 0. 15 U/
9、 ml hCG、0. 075 U/ ml 重组卵泡刺 激 素 （rFSH） 、 2 ng/ ml 表皮生长因子 （EGF） 及 0. 275 mg/ ml 丙酮 酸钠的组织培养液 （TCM） 199 中培养， 32 h 后， 选择其中已 经达到第二次减数分裂中期 （M） 的卵母细胞进行免疫染 色。 （2） 成熟卵母细胞的获取： 成熟卵母细胞来源于同期在 山东省立医院生殖医学中心就诊的 8 例多囊卵巢综合征不 孕症患者。患者年龄 26 33 岁， 平均 （27. 8 2. 7） 岁。8 例 患者行人绝经期促性腺激素 （hMG） 促排卵治疗， 卵泡发育 成熟后注射 hCG 10 000 U。如42
10、 h 后仍不排卵， 即进行人工 762中华妇产科杂志 2006 年 4 月第 41 卷第 4 期 Chin J Obstet Gynecol，April 2006，Vol. 41，No. 4 破卵； 如果卵泡数目较多， 在每侧穿刺 4 5 个优势卵泡后， 将其余卵泡全部抽吸出送实验室。选择其中 M期卵母细 胞放入人类输卵管液 （HTF） 中， 在 37 、 5% CO2的培养箱 中培养 1 2 h 后， 进行免疫染色。本研究获得患者的知情 同意。 2. 卵母细胞的免疫染色和标本观察： 将卵母细胞用 80 IU/ ml 透明质酸酶消化颗粒细胞后， 选择其中的 M期成熟 的卵母细胞经 2% 甲醛固
11、定， 经 0. 02% Triton X-100 （美国 Sigma 公司产品） 透化处理后， 进行免疫染色。将卵母细胞 移入 1: 250 的一抗 （单克隆抗 -微管抗体， 美国 Sigma 公司 产品） 中， 在 37 下孵化 1 h 后， 移入 1: 5000 的二抗 （生物 素结合的抗鼠 IgG 抗体， 美国 Sigma 公司产品） 中， 37 培养 箱中孵化 1 h， 再移入 1: 50 的三抗 （由荧光素异硫氰酸酯结 合的特异性抗生物素蛋白， 美国 Sigma 公司产品） 中， 37 培养箱中避光孵化 30 min。两次孵化之间用含有 5% 人血 白蛋白的磷酸盐缓冲液 （PBS）
12、冲洗标本。经 10 g/ ml 的碘 化溴乙啶 （美国 Sigma 公司产品） 进行染色后制片， 采用 LSM510 型激光共聚焦显微镜 （德国 ZEISS 公司生产） 进行 观察、 摄像。 3. 统计学方法： 采用 SPSS 11. 0 软件进行分析。计量资 料采用 t 检验。 二、 结果 经体外成熟培养后的卵母细胞共 64 个， 进行免疫染色 后， 可观察到染色体与纺锤体的卵母细胞为48 个 （75%） ； 体 内获得成熟的卵母细胞共 23 个， 进行免疫染色后， 可观察到 染色体与纺锤体的卵母细胞为 18 个 （78%） 。 卵母细胞纺锤体与染色体的正常形态同文献 1， 2 的 报道。纺
13、锤体呈梭状， 两极有点状结构； 染色体呈条状规则 地排列在赤道板上， 规则排列的纺锤体微管将两极点状结构 与赤道板上的染色体相连接。纺锤体异常表现为纺锤丝的 长度缩短， 部分或全部微管失去规则性或微管完全缺如。染 色体排列异常表现为染色体排列在赤道板染色体区之外， 或 染色体分散存在， 或有异常浅染的染色体。 与体内获得成熟的卵母细胞纺锤体与染色体进行比较， 体外成熟培养后卵母细胞的纺锤体形态异常者 21 个 （44%， 21/48） ， 明显高于体内成熟者 3 个 （17%， 3/18） ， 两者比较， 差异有统计学意义 （P 0. 05） 。体外成熟培养后卵母细胞 的染色体异常者 16 个
14、 （33%， 16/48） ， 明显高于体内成熟者 2 个 （11%， 2/18） ， 两者比较， 差异有统计学意义 （P 0. 05） 。 三、 讨论 纺锤体是细胞有丝分裂及配子成熟分裂过程中特有的 亚细胞结构， 是卵母细胞 M期中的重要细胞器， 它的结构 和功能正常与否， 直接影响生物个体的发育、 分化、 生长及繁 殖。纺锤体结构受到损害可影响染色体的正常迁移、 分离和 多倍体及异倍体的形成， 以至受精卵发育异常及非整倍体胚 胎的产生 3。 卵母细胞在体外成熟包括细胞核、 细胞质及细胞膜的成 熟。三者的同步成熟， 决定了卵母细胞将来的发育潜能。有 研究发现， 目前， 在体外培养体系中获得的
15、成熟卵母细胞形 成的胚胎发育潜能， 较体内获得的成熟卵母细胞差， 比正常 的胚胎更易发生卵裂阻滞和延迟， 以至不能继续发育到囊胚 阶段而致着床失败 4。在体外培养， 虽然细胞核能达到成 熟， 但细胞质还不能成熟， 未能为进一步的胚胎发育做好充 分的准备， 从而影响到形成胚胎的质量， 最终导致着床失败。 卵母细胞长期处于第一次减数分裂前期， 直到排卵前才 会完成第一次减数分裂， 其具体机制尚不十分清楚。体外培 养的卵母细胞在促性腺激素的作用下， 正常的调节机制不复 存在， 有些纺锤体和染色体异常的卵母细胞也同样可以获得 成熟， 而且体外培养的环境不如体内环境， 许多未知的因素， 可能也是造成在体
16、外成熟培养的卵母细胞的纺锤体和染色 体异常几率高于体内成熟培养卵母细胞的原因 。 Sanfins 等 5的一项研究发现， 体外成熟培养和体内成 熟培养的小鼠卵母细胞的纺锤体有很大差异。本研究结果 提示， 在体外成熟培养的卵母细胞有 44% 的纺锤体和 33% 的染色体出现异常， 可能造成体外成熟培养的卵母细胞， 在 受精后形成的胚胎发育能力较差。在已有的临床研究中， 我 们仅能获得 23. 7% 的优质胚胎， 这低于同期本生殖医学中 心的体外受精周期获得的优质胚胎率， 而且单胚着床率也低 于后者 6。这说明染色体的异常可能导致受精卵不能正常 分裂， 无法形成优质胚胎。虽然我们在给患者进行胚胎移
17、植 时， 会挑选优质胚胎， 可将染色体异常的胚胎移植率降到最 低， 但我们仍应重视体外成熟技术的安全性问题， 这也是所 有非生理状态下进行各种辅助生育技术的共性问题， 并应对 出生的婴儿进行长期随访观察。 参考文献 1Boiso I，Marti M，Santalo J， et al. A confocal microscopy analysis of the spindleandchromosomeconfigurationsofhumanoocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase stage. Hum Reprod，
18、 2002， 17： 1885-1891. 2Gook D，Osborn SM， Bourne H，et al.Fluorescent study of chromatin and tubulin in apparently unfertilized human oocytes following ICSI， Mol Hum Reprod， 1998， 4： 1130-1135. 3Wang WH，Keefe DL.Prediction of chromosome misalignment among in vitro matured human oocytes by spindle imag
19、ing with the PolScope. Fertil Steril， 2002， 78： 1077-1081. 4Junk SM，Dharmarajan A，Yovich JL. FSH priming improves oocyte maturation，but priming with FSH or hCG has no effect on subsequent embryonicdevelopmentinaninvitromaturation ogram. Theriogenology， 2003， 59： 1741-1749. 5Sanfins A，Lee GY，Plancha
20、CE，et al.Distinctions in meiotic spindle structure and assembly during in vitro and in vivo maturation of mouse oocytes. Biol Reprod， 2003， 69： 2059-2067. 6李媛， 姜晶晶， 马水英， 等 . 无刺激周期未成熟卵母细胞体外培 养用于多囊卵巢综合征不孕患者治疗的临床观察 . 中华妇产科 杂志， 2005， 40： 388-391. （收稿日期： 2005-03-31） （本文编辑： 赵小丽） 862中华妇产科杂志 2006 年 4 月第 41 卷第 4 期 Chin J Obstet Gynecol，April 2006，Vol. 41，No. 4