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1、中华血 液学杂 志 2 0 0 6 年 2月第 2 7 卷 Ch i n .1 H e m a m l . h e h m2 0 n 6 Vn l 2 7 N . , . 2 液病, H L A相合及不相合病例中均有稳定的干细胞植人， 未 出现严重的非血液学不良反应和移植相关死亡， 初步证明 F B C是一个适当的预处理方案。 移植后感染和G V H D是影响患者生存的最主要因素， 由 于F lu d是强免疫抑制剂, F B C具有强烈的免疫抑制效应， 加 上C ,s A, MMF和MT X的联合应用， 移植后的感染值得关注 我们仅观察到 1 例 C M V感染， 可能与移植后造血重建快有 关
2、。急性 G V H D在 H L A相合与不相合病例中发生率差异无 统计学意义， 慢性 G V H D发生率较高， 但多数为II度以下， 通 过联合激素治疗能够控制症状， 不影响患者的生存本组 2 2 例中8例为高危患者， 移植后给予 MM F , C s A决速减量和供 者淋巴细胞输注防治复发， 可能为。 G V H D高发的原因之一 减轻预处理强度是减少移植并发症， 提高生存质量， 扩 大移植受者人群的有效措施。研究证实， 经 G - C S F动员的骨 髓改变 r 供者淋巴细胞的某些性质， 有利于干细胞植人， 特 别适用于H L A不合的患者 e l ， 输人大剂量C D 3 4 + 细
3、胞可以 加强与宿主体内残存十细胞竞争力， 诱导宿主对移植物的免 疫耐受， 有利干造血重建le t 。 本组A B O血型一致的患者均 补充了经G - C S F动员的骨髓， 所有患者 C D 3 4十 细胞数量均 大于5 x 1 0 6 / k g ， 因 此， 尽管F B C的预处理强度减轻却达到 1 0 0 %的植入， 尤其对 H L A不合的 N B期患者其有较好的效 果 _ 参 考 文 献 鹿全意， 牛小青， 郭勇， 等 骨髓非清除性异基因造血+细胞治疗 白血病 5 例 临床分 析. 福 建医科 大学学报 ， 2 0 0 4 , 3 8 : 1 9 5 - 1 9 6 S la v i
4、n S , N a g le r A , N a p a rs t e k E , e t a l. N u m u y e l o a l d a t r e s te m c e l l tr a n s p la n ta tio n a n d ce l l th e r a p y a s a a lt e m m iv e to c o n v e n t io n a l b o n e m a r- tr w ,s p la m a t io n w it h le th a l c y m r e d u c t e n f o r th e t r e a t m e n
5、t o f m a l ig n a n t a n d n o n m a l ipa n t h e m e to l o g i c, d is e a s e s . R I- l , 19 9 8 , 9 1 : 7 5 6 - 7 6 3. 吴秉毅， 郭坤元， 宋朝阳等 F B C预处理力案在平相合异基因干 细 胞移植 中的应用 中华 血液学 杂志 2 0 0 2 ,2 3 : 1 9 4 - 1 9 7 黄 晓军 ， 韩伟 ， 许兰 平， 等 H L A配型 不合情 况 下造 血千 细胞 移植 的新方法 北京 大学学报 ( 医学版 ) ,2 0 0 4 , 3 6 : 2 2 9
6、 -2 3 3 纪树荃， 陈惠仁， 王恒湘， 等 供者应用粒细胞集落刺激因子促进 异 基因 F F n移植受 者造血 重建 的临 床研 究 中华 器官 移植 杂 志 ， 2 0 0 1 , 2 2 : 1 5 0 - 15 2 A v e rs e F , T a l u li o A ， V e l-I i A , e l. a l . T r ea t m e n t o f h ig h - ri s k a c u te l e u k m ia w it h T - c e l l -d e p le te d s te m c e lls f ro m re la t e d d
7、o n o r s w ith o n e 6 d ly m iv m a tr :h e d H L A h a p lm y p e . N E u g l J M e d , 1 9 9 8 , 3 3 9 : 1 1 8 6 - 日 9 2 ( 收 稿 日 期 : 2 0 0 5 -0 2 - 2 8 ) 伊马替尼治疗高嗜酸粒细胞综合征 F I N L I - P D G F R A融合基因变化的动态监测 李斌张广森 高嗜酸粒-1 11 胞综合征( H y p e re o s m n p h il i c s y n d r o m e , H E 勺是一种原囚不明的以嗜酸粒细胞持续
8、增高伴有多 脏器 受累的综合征。新近资料R . 示 5 6 % 一7 5 % 的 R E S患者 F I P I L I - P D G F R A融 合基因异常， , a l ， 我们采用实时荧光定 量R T - P C R法对 1 例接受伊马替尼治疗的H E S患者进行治 疗前后F I P I L l - P D G F R A融合基因的分析， 从分子水平评价 伊马替尼治疗HE S的效果 病 例 和 方 法 1 病例资料1 例 F IP I L l - P D G F R A阳性的 H E S患者系我 科作院病例 诊断标准及临床特点见文献 3 1 ， 用伊马替尼治 作 者单位 液研究室 通
9、信 作者 4 1 0 0 1 长沙 ， 中南 人学 湘雅 一厌院 血液 科 ， 分 子 血 张广森 , E m a il : z g s l lz p p u b li c . c e . h n 疗的初始剂量1 0 0 m g , 每日1 次， 服药7 d 后因自细胞总数及 嗜酸粒细胞比例降至正常而停药; 第5周后再予伊马替尼 1 0 0 m g何周2次， 第7周后减量为1 0 0 mg , 每周 1 次维持治 4 ? 2 试剂逆转录试剂盒购自P m m e g 。 公司I P D G F R A - R I , F I P I L I - F S、 P D G F R A - R 2 ,
10、F I P I L I - F 4扩增引物均由上海生工 生物下程技术服务有限公司合成， D N A高保真 T a q 酶购 白大 连宝生物公司。2 x H o t S t a rtla q P C R M i x购自B I O R A D公 司 ， 3 方法 3 . 1 粒细胞 R N A抽提及 , D N A的合成:用人中胜粒细胞分 离液分离出H E S患者服伊马替尼前后的外周血粒细胞， 调 整细胞密度约5x 1 0 冲L,T R l z o l/ 氯仿提取粒细胞总R N A ， 取 2 w g 总 R N A ， 用 R T试剂盒逆转录成 D N A模板，一 2 a保 存 各 用 。 中华
11、血 液学杂志 2 0 0 6年 2 月第 2 7 卷 第 2 期C h in J H - 1 0 , F e b m a rv 2 0 0 6 , V . 1 2 7 , N o . 2 3 . 2 阳性模板制备 从患者治疗前后外周血粒细胞中提取 总. R N A进行筑巢式R T - P C R扩增， 扩增产物经5 0 酬L 聚 丙烯酞胺凝胶电泳后， 嗅乙锭染色， 凝胶切割， 回收纯化， 并 进行测序分析证明F I P I L l - P D C F R A融合基因的存在。紫外 分光光度计定量c D N A模板， 稀释为I 护一 1 0 一 拷贝 / 闪。 引 物设计参考文献 1 ， 引物序列
12、为V 1 P I L l - F 4 ; 5 - A C C T G C T - G C T G A T C T TTC T G A T - 3 , P D G F R A - R I : 5 - P C A G A C C TTC TT- T TTC A C T G G A - 3 ; F IP I L I - F 5 : 5 - A A A C A G G A T A C G A A T G G - GA c ,i - r G - 3 , P D G F R A- R 2 : 5 - G G G 9 0 0 0 G C TTA -k T C C A T A G - 3 3 . 3 实时荧光
13、定量P C R : P C R总反应体系2 0闪， 2 x H o t - S ta rt T a q P C R M ix 1 0 闪 ( 含S Y B R G r e e n 染料) ， 引物浓度 1 . 5 P .m o l/ i . , c D N A模板1 闪。 P C R条 件: 9 5 3 0 s ,9 5 C 3 0 s , 9 53 m m， 然后9 52 0 s , 5 52 5 s , 7 2 3 0 s , 共4 5 个循环。以水为模板作阴性对照， 融链曲线检测 P C R特异 性 4 外周血嗜酸粒细胞计数及临床症状观察动态观察给予 伊马替尼治疗后， 该 H F S患者
14、的临床表现、 血常规及外周血 涂片嗜酸粒细胞分类计数以及肝、 脾、 心脏 B超等变化 结果 1 C , 值的测定及标准曲 线的建 立 各取1 0 0 一 () 拷n / P l 的F I P I L l - P D G F R A阳性模板 1闪进行实时荧光定量P C R, 得出相应的C ., 值 C r 值指 P C R扩增过程中， 荧光信号开始达 到指数增长( 设定的域值) 所对应的循环数 ， 绘制标准曲 线， 所得C : 值为1 7 - 3 2 ， 标准曲 线的斜率为3 . 3 6 , 线性系数 0 . 9 9 7, 巨实验重复3次 2 伊马替尼治疗前后 F I P I L 1 - P D
15、 G F R A m R N A拷贝数的动 态变化 伊马 替尼治疗前、 治疗后1 0 , 3 0 , 6 0 天患者F I P I L l - P D G F R A m R N A 的拷贝数分别为1 . 0 1 x 1 0 0 , 1 . 0 4x 1 0 ， 1 . 0 8 、 . 。， ， 1 一 0 0 x 1 0 - 4 ; 阴 性 对 照无 扩 增， 且 融链 曲 线 反应示单一峰， 证实了扩增的特异性 3 伊马替尼治疗 H E S前后血常规变化及临床反应伊马 替尼治疗前外周血白细胞 计数为1 0 . 2 x 1 ( 10 儿， 其中嗜酸粒 细胞比例为0 . 5 6 ,服用伊马替尼
16、( 1 0 0 m 盯d ) 3 d 后， 患者外 周血白细胞总数及嗜酸粒细胞比例均降至正常范围 分别为 3 . 4 x 1 0 今 L 和0 . 0 5 ， 自 觉症 状 消失， 肝脾 大 小恢 复正 常 服药后第 1 0天白细胞计数为3 . 0 x 1 0 / 1 . , 嗜酸粒细胞比例 为。 . 0 5 服药后第3 0大白细胞计 数为5 . 6 x 1 0 勺 L , 嗜酸粒 细胞比 例为0 . 0 3 0服药后第6 0 灭白 细胞计数为4 . 1 / l o v / L , 嗜酸粒细胞比例为0 . 0 1 ;追踪随访， 每月1次， 自细胞均 正常， 嗜酸粒细胞比例为0 . 0 2 -
17、0 . 0 6 ， 于用药半年后复发， 白 细胞持续增高 后 F I P I L 1 - P D C F R A融合基因的表达均呈时间依赖性下调， 但实时定量荧光 R T - P C R能精确地检测到基因拷贝数的细 微变化， 伴随着F I P I L l - P D ( ; F R A基因水平的降低， 患者的临 床症状与嗜酸 粒细胞比 例也有明显改善。B r m i fo r d 等川观察 伊马替尼( 3 0 0 - 4 0 0 m g / d ) 治疗慢性粒细胞白血病( C M L ) 的 分子疗效， 发现治疗后3 个月约9 3 %患者h - - h l m R N A水 平下降小于3 个对
18、数级; 而用实时定量R T - P C R 检测伊马替 尼治疗 H E S前后 F I P I L I - P D ( ; F R A基因拷贝， 尚未见报道 我们的研究表明, H E S患者经小剂量伊马替尼( 1 0 0 mg / d ) 治 疗2个月后, F I P l L 1 - P D C F R A n tR N A的拷贝数即 卜 降4个对 数级以 上， 提示小剂量伊马替尼能够使F I P I 1 .1 - P D G F R A融 合基囚表达受抑甚至转阴; 药物阻断 l l f 1 L l - P D C F R A表达 所需的剂量远较药物阻抑 li a r - s b l 表达所需
19、的剂量为低 S Y R R G 二二荧光染料实时监侧 P C R过程中双链 D N A 的合成过程， 具有简便、 快速的优点t 1 o L e v e tt 等 用S Y R R G r e e t 染料结合P C R融链曲线进行目的基因检测， 证明了该 方法具有良好的特异性和准确性。我们的结果显示， 以水为 模板的阴性对照无荧光量的变化， ft融链曲线呈现单一峰， 证实了扩增的特异性同时我们以 F I P I L l - P D G F R A融合基 因 筑巢式R T - P C R扩增的阳性产物， 纯化后稀释成1 0 0 l o - 拷 贝 / 闪不 同 浓 度 的 阳 性 模 板 制 定
20、 标 准 曲 线， 重 复 性好， 既提高了检出的敏感性， 又保证 厂 实验结果的准确性。因 此， 该方法对丁在临床上监测F I P I I .1 - P D G F R A阳性 H E S的 治疗反应 检测肿瘤克隆性微量残留病有一定意义 参 考 文 献 讨论 我们用实时荧光定量 R T - P C R动态监测 I例H E S患者 伊马替尼治疗 前后 F I P I L l - P D G F R A基囚表达变化， 并同时 与筑巢式R T - P C R 结果进行比 较1s 1 ， 结果表明伊马替尼治疗 C o o ls J , D e A n g e lo D J , G o d ib J
21、, e t a l. A t v - in , k i n a s e c r e a t e d b y f u s io n o f t h e P D G F R A a n d F IP I L l g e n e s a s a th e r a p e m i, ta rg , t o f , m a G n i b i n id io p a th ic h y p e - m o p h i b c sy n d ro m e . N E n g l J M e d , 2 0 0 3 , 3 4 8 : 1 2 0 1 - 1 2 1 4 张广森， 李斌， 裴敏飞， 等 高嗜
22、酸粒细胞综合征F I P I L l -P D G F R A 融 合基因 和转录 活化因子 5 蛋 白检 测中华 医学杂 志 2 0 0 4 , 8 4 1 5 4 1 - 1 5 4 4 . R ra n fo rd S , R o d e k i Z , I la 印 c r A, e t a l . Im m in ib p m d n e e s s ig , d G - e r m 听 so p , n r u , l, c o la r i e s p n n s e s - p a r e d to i n t e r fe r o n a lf s 讨 。 c y ta r
23、a b in e i n p a ti e n ts w i th n e w ly d ia g n o s e d c h ro n ic m y e l, ld le u k e m i a i n c h ro n ic p h a s e . L e u k e m ia , 2 0 0 3 , 17 , 2 4 0 1 - 2 4 0 9 李斌， 张广森， 戴崇文， 等 高嗜酸粒细胞综合征J A K / S T A T 信号 途径 的激 活及 对 甲磺 酸 伊 马替 尼 的 治疗 反 应中华 医 学 杂志 ， 2 0 0 5 , 8 5 : 4 4 8 -4 5 2 . p a n
24、 d e r V e lr le n V H , l f a c h h a o s A , C a z z a n i g a G, e t a l . D e t e e .t i, , , o f m in im a l r e s i d u a l d i s e a s e in h - a u lb ,g i c m a l ig n a n c ie s场 re a l- t im e q u a n ti ta t iv e P C R : p r in c i p l e s , a p p - , h , , , a na l h db o m m ry a s p e c ts I x u k e m i a ,2 0 0 3 , 1 7 : 1 0 1 3 - 1 0 3 4 L e a e n P V , M o r e y R R , G A L - y R L , e t a l . D e t e c t io n o f p a th o g e n i c l e p to s p - b y . . 1 -t i- q u a n tit a ti v e P C R . 7 M e a l l l ic m b in 1 , 2 0 0 5 , 5 4 : 4 54 9 ( 收稿F 1 期:2 0 0 5 -0 2 -2 1 )