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1、 1 3 6 实验研究 依那普利对高血压大鼠血管平滑肌细胞内游 离钙及蛋白激酶C活性的影响 王永霞朱明军钱义明2 陆 雄 吴 倩3何立人2 ( 河南中医学院第一附属医 院， 河南郑州 4 5 0 0 0 0 ; 2 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院， 上海 2 0 0 4 3 7 ; 3 上海中 医药大学， 上海 2 0 0 0 2 3 ) 摘要: 目的 观察依那普利抑制培养的血管平滑肌细胞增殖的机制。 方法以组织贴块法行自 发性高血 压大鼠( s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s iv e r a t s , S H R ) 主动脉血管平
2、滑肌细胞的分离培养， 并以倒置显微镜。 - S M 肌动蛋白 免疫组化法鉴定; 分别采用甲基唾RK基四q( M T T ) 法、 氖一 胸腺ePt核昔( H - T d R ) 掺人法、 荧光染 料( F U R A - 2 / A M ) 标记 法。 酶底物反应法观察依 那普利含药血清 对血管 平滑 肌增殖、 细胞内 游离钙、 蛋白 激 酶C 活性的影响。结果 与模型组比较， 依那普利含药血清对血管平滑肌增殖、 脱氧核糖核酸( D N A ) 合 成、 细胞内游离钙、 蛋白 激酶C 活性均有明显的抑制作用( P 0 .0 1 ) 。结论 依那普利可能通过降低细胞内 游离钙水平及抑制蛋白激酶C
3、 活性而发挥抑制血管平滑肌增殖和高血压血管重构的作用。 关键词: 血清药理学;血管平滑肌细胞; 增殖; 细胞内 游离钙; 蛋白 激酶C 中图分类号: R - 3 3 2 , R 9 7 2 .4文献标识码: A文章编号:1 0 0 7 - 9 6 8 8 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 3 6 - 0 3 E f f e c t s o f e n a l a p r i l o n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i o n a n d P K C a c t i v i t y i n c u l t u r e
4、d v a s c u l a r s mo o t h mu s c l e c e l l s o f s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e r a t s W a n g Y o n g x i a ，Z h u M i n g j u n ，Q i a n Y i m i n g 2 , L u X i o n g , W u Q i a n ，H e L i r e n 2 T h e F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o H e n a n C o l l e
5、 g e o f T C M，Z h e n g z h o u H e n a n 4 5 0 0 0 0 , C h i n a 2 Y u e y a n g I n t e g r a t e d H o s p i t a l o f C h i n e s e a n d W e s t e rn M e d i c i n e A f f i l i a t e d t o S h a n g h a i U n i v e r s i t y o f T C M，S h a n g h a i 2 0 0 4 3 7 ，C h i n a S h a n g h a i U n
6、 i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ，S h a n g h a i 2 0 0 0 2 3 ，C h i n a A b s t r a c t ; O b j e c t i v e s T o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f e n a l a p r i l o n c u l t u r e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( V S M C ) p ro l
7、if e r a ti o n . Me t h o d s V S M C w e re i s o l a t e d f ro m t h e m e d i a o f s p o n t a n e o u s h y p e r te n s i v e r a t s ( S H R ) a o r ta o b t a i n e d场 e x p l a n t m e t h o d a n d i d e n t if i e d b y i n v e rt e d m i c r o s c o p e a n d o - S M a c t i n i m m u
8、n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d . T h e e ff e c t s o f t h e d r u g c o n t a i n i n g s e r u m o n V S M C p ro l if e r a t i o n w a s o b s e r v e d b y M T T m e t h o d , D N A s y n t h e s i s b y H - T D R i n c o r p o r a t e d m e t h o d , i n t r a c e ll u l a r f r e
9、e c a l c i u m i o n ( C a t i ) b y F U R A 2 / A M m a r k i n g m e t h o d a n d p ro t e i n k i n a s e C ( P K C ) a c t i v i t y b y P e p T a g n o n - r a d i o a c t i v e P K C a s s a y . R e s u l t s E n a l a p r i l h a d i n h i b i t i n g e ff e c t s o n V S M C p r o l if e r
10、 a t i o n ， D N A s y n th e s i s a n d h y p e r - V S M C C a 2 i a n d P K C a c t iv i t y , w it h b e t t e r e ff e c t s t h a n c o n t r o l g ro u p . C o n c l u s i o n s E n a l a p r il h a s m a r k e d i n h i b i t o r y e ff e c t s o n t h e h y p e r - V S M C C a = i a n d P
11、K C a c t i v i t y , a n d h e n c e i m p r o v e t h e V S M C p r o l i f e r a ti o n a n d v a s c u l a r r e m o d e li n g . K e y w o r d s ; S e r u m p h a r m a c o l o g y ; V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l ; P r o l i f e r a t i o n ; F r e e c a l c i u m i o n ; P ro
12、 t e i n k i n a s e C 我们应用自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l y h y p e r te n s iv e r a ts , S H R ) 主 动 脉 培 养 血 管 平 滑 肌， 观察依那普利对血管平滑肌细胞增殖和D N A合 收稿日期: 2 0 0 6 - 0 2 - 0 7 作者简介: 王永霞( 1 9 7 5 - ) ， 女， 主治医师， 博士， 2 0 0 4 年毕业于上 海中医药大学， 研究方向: 中医药防治心血管病的临床与实验研 究。 联系电 话: 0 3 7 1 - 6 6 2 3 1 7 3 2 ; E - m
13、a i l : w y x c h z h q y a h o o . c o m .c n 成的抑制作用， 并观察该药对胞内游离钙和蛋白 激酶C ( p r o t e i n k i n a s e C , P K C ) 活性的影响。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物 清 洁 级S H R 4 只， 雄性， 8 周 龄， 体 重1 5 02 0 0 g ; 清 洁 级S p r a g u e - D a w l e y ( S D ) 大鼠2 0 只， 雄It , 8 周 龄， 岭南心血管病杂志2 0 0 6 年4 月第1 2 卷第2 期 1 3 7 体 重2 0 0 2 5 0
14、g ， 均由 上 海 第 二医 科 大 学 动 物 实 验中 心提供。 1 .2 主要试剂与仪器 R P M 1 1 6 4 0 培养 基， 小牛血清， 胰蛋白 酶， 牛 血 清白蛋白和甲基噬哩基四哇 ( m e t h y l t h i a z o l y l t e t r a z o l i u m , M T T )试剂盒购自G I B C O公司; T r i t o n X - 1 0 0 , E G T A( 乙二醇四乙酸醋， e t h y l e n e g l y c o l - t e t r a a c e t e ) ，二甲基亚矾 ( D i m a t h y l
15、 s u l f o x i d e , D M S O ) , a - S M肌动蛋白， S i g m a 公司; 放射性标记胸 腺嘀 陡 核 昔 3 H - T d R , tr i ti a t e d t h y m i d i n e( 1 m C i/ m l ) ， 中国 科学院上海核技术开发公司; F U R A - 2 / A M , C A L B I O C H E M公司产品， P e p T a g非放射性 P K C试剂盒， P r o m e g a 公司; 依那普利片， 批号 0 2 0 2 2 5 ， 江苏扬子药业公司提供; 电 热恒温振荡水 箱D K Z
16、- 2 型， 上海精宏实验设备有限公司; 酶标 仪， E L X 8 0 0 型， B io T e x I n s t r u m e n t I N C ; 液闪 仪， B E C K M A N 公司W A L L A C E 1 4 1 0 型; 双波长荧光分 光光度计， 日 本H I T A C H I F - 4 5 0 0 型。 1 . 3 实验方法 1 . 3 . 1 自 发性高血压大鼠主动脉血管平滑肌细胞 的分离培养采用组织贴块法川 分离培养血管平 滑肌细胞 ( v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , V S M
17、 C ) 无菌条件下分离S H R胸主动脉中层平滑肌， 剪成 约1 m m 的组织块， 放人含 1 0 % 小牛血清的R P M I 1 6 4 0 培养液培养， 培养液内含轻乙基呱嚓乙磺酸 ( h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i c a c i d ， H E P E S ) , N a H C 0 3 ， 青霉素钠和链霉素。细胞鉴定 用光学显微镜和。 - S M肌动蛋白免疫组化。选择 生长良好的第6 - 8 代血管平滑肌细胞用于实验， 均分为依那普利组和模型组， 每组4 个复孔。 1 .
18、 3 . 2 含药血清的制备S D大鼠分为2 组， 每组 1 0 只。依那普利组给予依那普利灌胃，剂量6 m g “ k g - - d - ， 给药容量1 m l / 1 0 0 g 体重， 空白 药 物血清组，给予等体积生理氯化钠， 每日 给药2 次， 连续3 d ， 第4日 给药2h 后， 用4 % 戊巴比 妥钠 腹腔注 射4 0 m g / k g 麻醉， 无菌下腔静脉采血， 4 0 C 静置4h 后， 离心提取血清，同组血清混匀， 5 6 灭 活3 0 m i n ， - 2 0 保存， 用前0 .2 2 l t,m 滤膜除菌。 1 . 3 . 3 含药血清对血管平滑肌细胞增殖的影响
19、 采用M T T 法， 按1 0 4 个/ T L 细胞接种在%孔板 内( 每孔2 0 0闪) 培养2 4 h ， 换无血清培养基同步 化2 4 h ， 将含1 0 % 浓度各不同药物的含药血清及空 白 血清加人相应各组培养板中， 继续培养2 4 h ， 每 孔加人M T T ( 5 m g / m l ) 液2 0 p l ， 继续培养4 h ， 去 上清， 每孔加入D M S O 1 5 0 id ， 振荡 1 0 m i n ， 用酶 标仪用4 9 0 n m波长测吸光度。 1 . 3 . 4 含药血清对血管平滑肌细胞 D N A合成的 影响 采用氖一 胸腺啼陡核昔( 3 H - T d
20、 R ) 掺人法。 分 为本底组， 仅加空白 血清， 不加 H - T d R ， 模型组， 加空白 血清， 并加人 H - T d R ， 终浓度为1 . 8 5 x 1 0 $ B q / m l ， 下同) ， 依那普利组加人含药血清及 H - T d R ( 同上) ， 处理后以放射免疫测定法检测。 1 . 3 . 5 含药血清对血管平滑肌细胞游离钙的影响 采用荧光染料( F U R A - 2 / A M ) 标记法， 处理后 以双波长荧光分光光度计测定，发射波长为5 1 0 n m ，激发波长为3 4 0 n m和3 8 0 n m ，光栅为 1 0 n m ， 依次测定静息期荧光
21、值、 最大荧光值R .( 加 人0 . 1 % T ri t o n X - 1 0 0按每管5 0川) 和最小荧光强 度值 R Q ;. 加人 1 0 0 m m o l / L浓度的E G T A 1 0 0 R 1。根据F u r a - 2 与C a Z 十 反应的解离常数 K d 为 2 2 4 n m o l / L ， 实验条件下的测定的荧光强度R ， 用 下式计算细胞内钙浓度 C a Z + 单位为1 0 - 9 m o l / L o C a Z + i = 凡( R - R Q ;. ) R 一 R 1 . 3 . 6 含药血清对血管平滑肌细胞蛋白激酶 C 活性的影响 按照
22、P r o m e g a 公司非放射性P K C 测 定试剂盒说明书进行。取生长至亚融合状态的第 4 - 8 代S H R主动脉平滑肌细胞接种6 孔板( 1 0 5 个/ m l ， 每孔3 m l ) ， 无血清静止2 4 h ， 以含 1 0 % 不同含药血清及 1 0 % 空白血清的培养液继续培养 4 8 h ， 抽提、 浓缩、 定量蛋白。 样品按试剂盒酶底物 反应体系操作上样， 琼脂糖凝胶电泳， 紫外灯下分 析结果、 拍照， 取已磷酸化底物荧光条融化， 抗凝 后在荧光分光光度计上5 7 0 n m波长下读取光吸 收值， 进行P K C 活性的检测。 1 .4 统计学方法 采用S P
23、S S 1 1 . 0 f o r W i n d o w 。 统计分析软件， 计量资料以均数士 标准差行土 : ) 表示， 组间比 较采 用单因素方差分析，先确定样本是否符合正态分 布， 再行方差齐性检验， 根据方差齐性选用检验方 法; 治疗前后比 较采用配对 检验。 2 结果 2 . 1 培养血管平滑肌鉴定 培养血管平滑肌细胞在倒置显微镜下呈梭 1 3 8 形， 可重叠生长达多层， 高低起伏呈峰谷型生长; 免疫组化。 - S M肌动蛋白 呈强阳性染色。 2 . 2 对血管平滑肌增殖的影响 光吸收值反映存活的细胞数， 依那普利组的 光吸收值为1 . 4 3 士 0 .0 6 ， 而 模型组为
24、1 .5 6 1 0 .0 4 ， 依那 普利抑制率为8 .3%， 差异有统计学意义( P 0 .0 5 ) ， 说明依那普利对血管平滑肌增殖有显著抑制作用。 2 . 3 各药物血清对血管平滑肌D N A合成的影响 3 H - T D R是血管平滑肌D N A合成的指标， 空 白 组本底为( 6 6 土 1 0 ) c p m ， 与模型组为( 6 8 士 4 ) x 1 0 0 c p m ， 依那普利 药物血清 组为( 5 2 1 6 ) x 1 0 0 c p m ， 抑 制率为2 3 . 3 %， 有统计学意义( P 0 . 0 5 ) 。 说明依那 普利药物血清 抑制D N A的合成
25、。 2 .4 对血管平滑肌细胞内游离钙及蛋白激酶C 活性的影响 培养血管平滑肌细胞内 钙， 模型组为 ( 2 5 4 土 2 0 ) x 1 0 - 9 m o l / L ， 依那普利药物血清组为( 2 1 0 1 9 ) x 1 0 - 9 m o l / L ，差异有统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) , P K C 活性的光吸收单位， 模型组为( 1 0 6 士 1 4 ) x 1 0 光吸 收 单位， 依那普利药物血清 组为 ( 9 1 1 1 0 ) x 1 0光 吸收单位， 差异有统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) o 细胞的 胞内游离钙， 无论静息状态还是激动药作 用下
26、都比正常对照高 3 ; 细胞内游离钙增高可激 活各种细胞内信号转导途径， 使血管平滑肌增殖 与肥大， 从而导致血管壁增厚和循环阻力增加， 是 高血压发生发展的重要病理学基础， 因此， 减少细 胞内游离钙是阻止细胞增殖与肥大的重要环节。 P K C是C a 2 + 和磷脂依赖性的丝氨酸/ 苏氨酸 蛋白 激酶， 催化多种靶蛋白发生磷酸化， 完成细胞 对外源性信号的应答 4 1 。最主要P K C活化途径是 胞膜磷脂酶系统激活和上调细胞内游离钙，P K C 活化， 参与细胞内基因调控， 导致细胞核酸及蛋白 质合成增加， 促进肥厚发生发展 s , 6 1 血管紧张素转化酶抑制药使血管紧张素II 生 成
27、减少， 间 接降 低P K C 活性。 K a n a y a m a 认为血管 紧张素转化酶抑制药可直接抑制P K C ， 可能是此 类药物作用的新途径，改善血管平滑肌细胞肥大、 增生及血管重构。 本组实验结果表明依那普利作用 与上述报道一致$ l 。依那普利对细胞内C a 2 做 度的 下调作用， 是否与抑制血管紧张素II 受体的后效应 有关， 或与抑制P K C 有关， 有待进一步研究。 参考文献: ，J，J 1卫，一 r.L一L 卜J仁Jlesesl，esesJ 内j4工I 户lesLFesLrL 3 讨论 血管重构 2 1 指血管各种结构和功能的改变， 既是高血压病的重要病理改变，
28、又是高血压维持、 恶化及靶器官损害的结构基础，因此逆转血管重 构， 对高血压病的防治及预后都有重要意义。S H R 是遗传性相关的高血压动物模型， 以S H R的血管平 滑肌细胞为研究对象是合理的。 M TT法通过显示活细胞数量， 细胞线粒体代谢 酶活性间接反映细胞的增殖情况， 依那普利组光吸 收值明显低于模型组， 说明其有抑制血管平滑肌细 胞增殖的作用; 胸腺嚓陡是D N A 合成必需原料， 测 定 H - T d R 掺人量可反映细胞D N A的合成， 结果显 示 依那普 利可明 显抑制 H - T d R的 掺入， 加上M T T 法结果说明依那普利药物血清对S H R的血管平滑 肌细胞
29、增殖有抑制作用， 揭示了 依那普利可通过抑 制血管平滑肌细胞增殖改善高血压血管重构。 血管平滑肌细胞的增殖和肥大是血管重构的 中心环节之一，而细胞内游离钙是介导血管平滑 肌细胞增殖和肥大的转导分子。原发性高血压患 者和自 发性高血压动物， 其血管平滑肌以及循环 司徒镇强，吴军正. 细胞培养【 MI . 1 版. 西安:世界图 书出版公司， 1 9 9 6 : 6 8 - 7 2 . D U N N W R , T A L L I S S J , G A R D I N E R S M . R e m o d e l i n g a n d e n h a n c e d m y o g e n
30、 i ct o n e i n c e re b r a l r e s i s t a n c e a rt e r i e s i s o l a t e d f ro m g e n e t i c a l l y h y p e rt e n s i v e B r a t t l e b o ro r a t s J . J V a s e R e s , 1 9 9 8 , 3 5 ( l ) : 1 8 - 2 6 . 孙宁玲，徐成斌. 今日 高血压【 M . 北京: 中国医药科技 出版社，2 0 0 0 : 1 5 2 - 1 7 2 . 卢建，余应年，徐仁宝. 受体信号转导系
31、统与疾病【 M . 济南: 山东科学技术出版社，1 9 9 9 : 8 . 饶曼人，刘宛斌，张晓文. 前胡丙素对A n g l l 致离体血管 平滑肌细胞肥厚及胞内钙N O 含量和信号转导的影响 J . 药学学报，2 0 0 2 , 3 7 ( 1 ) : 5 - 9 . T O U Y Z R M, S C H I F F R I N E L . S ig n a l t r a n s d u c ti o n m e c h a n i s m s m e d i a t i n g t h e p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h 叩h y s
32、 i o l o g i c a l a c t i o n s o f a n g i o t e n s i n I I i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e ll s J . P h a r m a c o l R e v , 2 0 0 0 , 5 2 ( 4 ) : 6 3 9 - 6 7 2 . K A N A Y A M A Y, N E G O R O N , O K A M U R A M, e t a l . M o d u l a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i n a o rt a o f s p o n t a n e o u s l y h y p e rt e n s i v e r a t s w i t h e n a l a p r i l t r e a t m e n t J . O s a k a C i t y M e d J , 1 9 9 4 , 4 0 ( 2 ) : 8 3 - 9 7 . 周建中， 雷寒， 陈运贞， 等. 灯盏细辛注射液对自 发性高血 压大鼠 心室及血管重构的影响【 J . 中国中 西医 结合杂志， 2 0 0 2 , 2 2 ( 2 ) : 1 2 2 - 1 2 5 .