依普利酮联合替米沙坦对自发性高血压大鼠肾脏足细胞Nephrin表达和肾脏保护作用的影响.pdf

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1、2 0 1 0 年8 月第1 7 卷第2 3 期论著 依普利酮联合替米沙坦对自发性高血压大鼠肾脏 足细胞N e p h r i n 表达和肾脏保护作用的影响 郭旭他于波t ( 1 中国医科大学附属第一医院心血管内科，辽宁沈阳1 1 0 0 0 1 ；2 沈阳医学院奉天医院，辽宁沈阳1 1 0 0 2 4 ) 【摘要1 目的：研究依普利酮、替米沙坦对自发性高血压大鼠肾脏保护作用和足细胞N e p h r i n 蛋白表达的影响。方法： 5 只1 2 周雄性W i s t a r - K 3 ，o t o ( W K Y ) 大鼠为对照组( A 组) 、2 0 只自发性高血压大鼠( S H R )

2、 随机分为高血压组( B 组) 和 替米沙坦治疗组( C 组) ，依普利酮治疗组( D 组) ，替米沙坦、依普利酮联合治疗组( E ) 。A 、B 组用等量饮用水灌胃，C 组用 替米沙： f l 1 0m g 他g d ) 】灌胃，D 组用依普利酮 1 0 0m g ( k g d ) 】灌胃，E 组依普利酮【1 0 0m g ( k g d ) 】+ 替米沙坦【1 0m g ( k g d ) 】 灌胃8 周。测定治疗前后2 4h 尿蛋白量，肌酐，尿素氮水平，并观察肾脏病理改变；免疫组化法检测肾脏n e p h r i n 表 达变化。结果：B 组血压和尿蛋白较A 组逐渐升高( P O 0

3、5 ) 。B 组肾小球硬化指数和间质纤维化指数均明显高于A 组 ( P O 0 5 ) ，n e p h f i n 蛋白表达较A 组降低。C 、D 和E 组血压、尿蛋白和病理损伤较B 组减轻，n e p h r i n 表达显著高于B 组伙0 0 5 ) 。结论：依普利酮联合替米沙坦通过上调足细胞n e p h r i n 表达，减轻自发性高血压大鼠肾损伤。 f 关键词1 高血压肾损害；替米沙坦；N e p h r i n ；依普刺酮 【中图分类号】R 一3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 牟4 7 2 1 ( 2 0 1 0 ) 0 8 ( b ) - 0 0 9 0 3 E

4、 f f e c t s o ft e i m i s a r t a na n d e p l e r e n o n e o nr e n o p r o t e c t i o na n dN e p h r i n e x p r e s s i o ni np o d o c y t e so fs p o n e t a n o u s eh y p e r t e n s i o nr a t s G U OX d 2 ，Y U B 0 7 ( 1 D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y ，T h eF i r s tH o s p i

5、 t a lo fC h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t y ，L i a o n i n gP r o v i n c e ，S h e n y a n g1 1 0 0 0 1 ，C h i - n a ；2 t h eF e n g t i a nH o s p i t a lo fS h e n y a n gM e d i c a lC o l l e d g e ，L i a o n i n gP r o v i n c e ，S h e n y a n g 1 1 0 0 2 4 ，C h i n a ) A b s t r a c t O

6、 b j e c t i v e ：T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fe p l e r e n o n e ，t e l m i s a r t a no nt h er e n a lf u n c t i o na n dp o d o e a l y = ne x p r e s s i o n i np e d o c y t e so fs p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ( S H R s ) M e t h o d s ：T w e n t y1 2

7、一w e e k o l dm a l eS H R sw e l er a n d o m l y 鹪一 s i g n e di n t ot h r e eg r o u p s ：h y p e r t e n s i v eg r o u p ，a n dt e l m i s a x t a n t r e a t e dg r o u p = 5r e s p e c t i v e l y ) ，e p l e r e n o n e t r e a t e dg r o u p = 5r e s p e c t i v e l y ) ，e p l e r e n o n e

8、 + t e l m i s a r t a n - t r e a t e dg r o u p ( n = 5r e s p e c t i v e l y ) B l o o dp r e s s u r ea n dp r o t e i n u r i aw e r em e a s u r e d b e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n t R e n a lp a t h o l o g i c a lc h a n g e sw e r eq u a n t i f i e db yt h ei n d i c e so fg l o

9、m e r u i o s c l e r o s i s ( G S ) a n di n t e r - s t i t i a lf i b r o s i s ( I V ) E x p r e s s i o no fn e p h r i nW i l l sa n a l y z e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g R e s u l t s ：T h ep r o t e i n u r i aa n dh y p e r t e n s i o ni nh y p e r t e n s i v

10、 em r sw e r es i g n i f i c a n t l ya l l e v i a t e da f t e rt e l m i s a r t a na n de p l e r e n o n et r e a t m e n t I na d d i t i o n ，d o w n r e g u l a t i o n o fn e p h r i ne x p r e s s i o ni ng l o m e r u l ia n dp a t h o l o g i c a ld a n l a g e 8i nS H R sw e r ep r e v

11、 e n t e db yt e l m i s a n a na n d e l p e r e n o n ei n t e r v e n t i o n C o n c l u s i o n ：T e l m i s a r t a na n de p l e r e n o n ee x e r t sap r o t e c t i v ee f f e c to ni m p r o v i n ge x p r e s s i o no f n e p h r i ni ng l o m e r u l it op r e v e n tt h ep r o g r e s

12、s i o no fh y p e r t e n s i v er e n a ld a m a g e 【K e yw o r d s 】H y p e r t e n s i v er e n e ld i s e a s e ；T e l m i s a r t a n ；N e p h r i n ；E p l e r e n o n e 高血压是导致慢性肾脏病的主要原因之一，微量清蛋白 尿是高血压肾损害的早期临床症状和肾功能进展的独立危 险因素 1 J 。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分之一，位 于肾小球基底膜( G B M ) # F 层，通过其电荷屏障和分子屏障功 能控制血

13、浆蛋白滤过其损伤与蛋白尿的发生发展密切相 关儡。足细胞袋隙膜上的n e p h f i n 是肾小球滤过屏障的关键组 成部分。其分布和表达改变是多种肾小球疾病的发病机制之 一，缺乏n e p h f i n 蛋白可导致裂隙膜结构丧失产生大量的蛋 白尿及肾衰竭翻。新近研究显示，在D a l l l 盐高血压大鼠模型早 期即存在足细胞损伤，足细胞特异蛋白n e p h f i n 表达降低1 4 。 足细胞电荷屏障损伤是否参与高血压蛋白尿的发生发展未 见报道。本研究拟通过自发性高血压大鼠模型，观察肾小球 足细胞n e p h r i n 表达变化以及R a g 系统拮抗剂依普利酮和替 米沙坦的十预

14、作用。 1 材料与方法 1 1 材料 依普利酮( 北京诺华) ，替米沙坦( 北京诺华) ，兔抗n e p h r i n 多克隆抗体、二抗试剂盒( 武汉博士德生物技术有限公司) 。 1 2 模型与分组 体重2 2 0 2 5 0g 雄性S H R 大鼠H 匕京维通利华实验动物 中一0 ) 2 0 只，随机分为高血压组( B ) 、替米沙坦治疗组( C ) 、依普 利酮治疗组( D ) 、替米沙坦和依普利酮联合治疗组( E ) ，另取同 龄同性京都大鼠( w i s t a r - k y o t or a t s ，W K Y ) 5 只，体重2 2 0 - 2 5 0g ， 作为对照组，C

15、组替米沙坦【1 0m g ( k g d ) 】灌胃8 周，D 组依普 C H I N AM O D E R NM E D I C l N E 中国当代医药9 万方数据 论著2 0 1 0 年8 月第1 7 卷第2 3 期 利酮 1 0 0m g O , g d ) 】灌胃8 周，E 组依普利酮【1 0 0m # ( k g d ) 】+ 替米沙坦 1 0m # O , g d ) 】灌胃8 周。A 组和B 组用等量饮用水 灌胃。实验动物由中国医科大学S P F 级动物实验中心集中饲 养。 1 3 实验方法 1 3 1 尾动脉收缩压、2 4h 尿蛋白量：采用尾套式大鼠心率血 压测定仪( 日本S

16、 o f t r o nC oL t d 公司研制) 分别于灌胃前后测 量清醒状态下尾动脉收缩压，取3 次测量值的均值。实验前 后收集2 4h 尿液，采用磺基水杨酸法测定2 4h 尿蛋白定量。 1 3 2 于8 周后1 0 水合氯醛麻醉动物后心脏采血，E D T A 抗 凝管和促凝管收集血液，分别分离血浆和血清，检测血浆血 尿素氮( B U N ) 和血肌酐( s c r ) ；称量大鼠肾脏和体重。 1 3 3 肾脏病理学观察：实验第8 周时麻醉，腹正中切E l 取肾 脏去包膜，部分肾组织置于1 0 的中性甲醛溶液中固定，制 成3 m 切片后行常规H E 染色、镜检。透射电镜：约1m 3 大小

17、肾皮质经固定、包埋，制成5 0 岬切片后行铀铅双染色 并在电镜下观察。 1 3 4 免疫组织化学检测肾脏n e p h r i n 蛋白表达：肾组织 n e p h r i n 蛋白检测按s P 试剂盒f 北京博士德生物技术有限公 司) 进行。4 斗m 厚石蜡切片常规脱蜡、修复后，与浓度为 1 ：2 5 0 的兔抗大鼠多克隆抗体在4 0 C 下孵育，并进行D A B 显色、 脱水封片。将切片于O L Y M P U S 显微镜下、H P I A S 一2 0 0 0 多 媒体彩色病理图像分析系统( 中国医科大学提供) 处理，每例 4 0 0 倍随机选择1 0 个肾小球的视野，计算每个肾小球内的

18、 阳性信号面积与肾小球面积的比值，取其平均值作为该实验 动物的指标值。计算各组肾小球内n e p h r i n 的阳性物质的相 对含量。 1 4 统计学处理 数据以均数标准差表示采用S P S S1 1 5 统计软件进行 分析。组间比较采用t 检验，P O 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 大鼠血压、尿蛋白变化 实验前B 、C 、D 和E 组血压和尿蛋白均较A 组明显上升 ( P 0 0 5 ) 。且4 组间差异无统计学意义，见表1 。8 周后B 、C 、D 和E 组血压、2 4h 尿蛋白和B U N 、S c r 显著高于A 组，经依普 利酮和( 或) 替米沙坦干预后，上述指

19、标均降低；8 周E 组指 标降低更明显( P 0 0 1 ) ，见表2 。 2 2 肾脏病理学观察 光镜下，A 组肾小球、肾小管无病理改变。B 组肾小球体 积缩小，肾小球系膜基质增生。入球小动脉管壁增厚，管腔狭 襄1 实验前各组大鼠血压和蛋白尿的比较伍s ，n = 5 ) T a b l o1T h er a t sb e f o r et h ee x p e r i m e n tc o m p a r i s o no fb l o o dp r e s s u r ea n dp r o t e i n u d a 伍- + - S ，n - - 5 ) 项目A 组B 组C 组D 组E

20、 组 收缩压( 咖H g ) 1 1 5 0 0 - 1 0 5 11 8 8 2 0 - J ：1 2 1 0 “1 8 0 2 0 - J ：9 2 0 “1 8 3 7 0 - J = 1 3 2 5 1 8 4 0 0 - J ：9 7 6 墨鱼垦f 竖竺垃! ! ：! ! 生：i !坠：兰箜i ! ：竺：! ! ：竺：圭i i ：笙：塑：垒i 圭i Q ：! i ：! ! ：! 鱼丝! ：! ! ： 与A 组比较。尸O 0 5 囊2 实验8 局后各组大鼠各项指标的比较辑奶，n = 5 ) T a b l e2A f t e r8w e e k s ，t h er a t s m p

21、a r i s o no ft h ei n d i c a t o r s 伍s ，n = 5 ) 项目A 组B 组C 组D 组E 组 收缩N ( m m H g ) 1 1 5 0 0 1 0 5 11 9 2 2 2 1 8 5 6 “1 5 6 3 3 1 0 4 6 1 7 3 6 4 2 0 “1 3 2 ，2 2 - , - 2 3 2 6 蛋白尿( m 2 4h 、 1 2 5 6 - x - 6 3 49 6 4 5 - * 3 5 6 7 +5 2 1 4 2 8 8 7 4 9 9 7 3 0 3 5 4 3 3 6 - J ：2 5 6 7 6 B U N ( m m

22、o l L )6 8 6 - x - 0 9 78 9 l 1 2 4 8 2 5 1 0 3 8 4 0 1 5 8 8 3 2 i - 0 9 8 6 S e r ( 肛m o l F L ) 3 9 0 9 - J ：8 7 95 2 8 0 1 0 0 伊4 5 2 5 9 5 6 4 3 4 5 8 5 6 4 5 1 8 + 7 2 8 4 L R B W f ) 3 9 ：t - 0 53 7 0 2 3 6 i 4 ) 3 3 6 i - 0 6 4 ，O - x - O 2 6 与A 组比较，? P O 0 5 ；与B 组比较，? P O 0 5 ，A p o 0 l 窄或梗

23、阻，中层平滑肌层数增多。系膜细胞增生，肾小球局灶 性硬化；肾间质充血、炎性细胞浸润。细胞外基质( E C M ) 增多 并沉积，间质纤维化。C 、D 、E 组肾小球病变较B 组减轻。见 图1 。 透射电镜发现B 组出现足突节段性融合，足细胞微绒 毛化，部分足细胞核染色质浓缩、边集。C 、D 和E 组足突融 合较B 组轻。见图2 。 2 3 免疫组织化学检测肾脏n e p h r i n 蛋白表达 免疫组化显示A 组n e p h r i n 沿肾小球基底膜呈线性表 达，B 组n e p h r i nI O D 显著低于A 组【( 1 3 2 5 + 3 4 1 ) 比( 3 3 5 6 +

24、6 6 5 ) ，P O 。0 5 1 ；与B 组相比，C 、D 、E 治疗显著增加n e p h r i n 蛋 白表达【( 1 3 2 5 + 3 ，4 I ) 比( 2 0 1 4 3 6 4 ) ，P O 0 5 ；E 组n e p h r i n 蛋 1 0 中国当代医药C H I N AM O D I = F I NM E D I C I N E 白表达增加更显著I ( 1 3 2 5 3 4 1 ) 比( 3 0 4 7 5 。6 5 ) ，P O 0 1 】。见 图3 。 3 讨论 肾脏不仅在系统血压的调节中起着重要作用同时也是 高血压的重要靶器官之一。目前认为微量清蛋白尿和蛋

25、白尿 是高血压肾损害的早期诊断指标和独立危险因素l I l 。本研究 自发性高血压大鼠血压模型发现随着时间延长血压逐渐上 升。8 周蛋白尿显著高于对照组并出现肾小球节段硬化和肾 间质损伤等病理变化，与文献报道一致1 4 。n e p h r i n 的相对分 子质量1 80 0 0 。由l2 4 1 个氨基酸所组成，属于免疫球蛋白 超家族分子1 5 1 。参与细胞的信号转导、维持足细胞的正常形态 和功能。其蛋白和基因异常在蛋白尿的发生机制中具有十分 万方数据 2 0 1 0 年8 月第1 7 卷第2 3 期论著 图1光镜下各组大鼠肾脏组织学改变( H E 。x 4 0 0 ) A ：W K Y

26、 组；B ：S H R 组；C ：替米沙坦组；D ：依普利酮；E ：替米沙坦+ 依普利 酮组 图3 各组大鼠肾脏足细胞内n e p h d n 蛋白的表达( 免疫组化x 4 0 0 ) A ：W K Y 组；B ：S H R 组；C ：替米沙坦组；D ：依普利酮；E ：替米沙坦+ 依普利 酮组 图2电镜下各组大鼠肾脏组织学改变( H E 。80 0 0 ) A ：W K Y 组；B ：S H R 组；C ：替米沙坦组；D ：依普利酮；E ：替米沙坦+ 依普利 酮组 重要的作用旧。依普利酮是一种新型无性激素样不良反应的 选择性醛同酮受体拮抗剂。本研究发现，依普利酮可明显降 低大鼠血压、u A E

27、 R 和肾小球损伤与在醛固酮一盐高血压模 型中研究结果一致同。S h m a t aS 等嘶究证实醛同酮通过上调 S g k l 表达诱导氧化应激，导致足细胞损伤。依普利酮可能通 过减少氧化应激而稳定n e p h r i n 表达，减少细胞凋亡。替米沙 坦通过上调足细胞p o d o c a l y x i n 表达减轻D O C A 高血压大 鼠肾损伤唧。中年龄S H R s 的血浆醛固酮水平增高【1 0 1 。依普利 酮可通过非血流动力学作用部分阻断A L D 的损伤效应1 1 l 】。 总之，依普利酮和替米沙坦联合应用，可以使足细胞损 伤明显减轻，通过使n e p h r i nm R

28、 N A 表达上调、蛋白尿减少保 护肾脏，延缓了肾脏疾病的进展。 【参考文献】 【1 】F u t r a k u lN ，S r i d a r n aV ，F u t r a k u lP M i c r o a l b u m i n - u r i a - ab i o m a r k e ro f r e n a lm i c r o v a s c u l a rd i s e a s e J R e n F a i l ，2 0 0 9 ，3 l ( 2 ) ：1 4 0 - 1 4 3 【2 lD u r v a s u l aR V ，S h a n k l a n dS J

29、 P o d e c y t ei n j u r ya n dt a r g e t l a gt h e r a p y ： A nu p d a t e u 】C u r rO p i nN e p h r o lH y p e r t e n s ，2 0 0 6 ，1 5 ( 1 ) ：1 - 7 【3 】G e r t hV E ，孙X ，V i z eP D N e p h r i ne x p r e s s i o na n dt h r e e - d i m e n s i o n a l m o r p h o g e n e s i so ft h eX e n o

30、p u sp r o n e p h r i cg l o m u s J D e v l 枷，2 0 0 5 ，2 3 3 ( 3 ) ：l1 3 l l1 3 9 4 1 K a n k eB ，C o r d a s i cN ，H a r t n e rA ，e ta 1 B l o o dp r e s s u r ev e r s u sd i r e c t m i n e r a l o c o r t i c o i de f f e c t so nk i d n e y i n f l a m m a t i o na n df i b r o s i si nD O C

31、 A - s a J th y p e r t e n s i o n J N e p h r o lD i a lT r a n s p l a n t ，2 0 0 8 ，2 3 ( 11 ) ：3 4 5 6 - 3 4 6 3 【5 】5 W a r t i o v a a r aJ , O f v e r s t e d t 崛K h o s h n c o d iL e ta 1 N e p h r i ns t r a n d sc o n t r i b u t e t oap o r o u ss l i td i a p h r a g ms c a f f o l da

32、8m v e a l e db ye l e c t r o nt o m o g r a p h y 【J 】J Cl i nI n v e s t , 2 0 0 4 ，1l ( 4 ) ：1 4 7 5 - 1 4 8 3 【6 】W o l fG ，C h e nS z i y a d e hF N ，e ta 1 F r o mt h ep e r i p h e r yo fg l o m e r u l a r c a p i l l a r yw a l lt o w a r dt h ec e n t e ro fd i s e a s e ：p o d o c y t ei

33、 n j u r yc o m e so fa g e i n d i a b e t i cn e p h r o p a t h y f J D i a b e t e s ，2 0 0 5 , 4 5 ( 4 ) ：1 6 2 6 - 1 6 3 4 【7 】B l a s iE R ，R e c h a 凡R u d o l p hA E ，e ta 1 A l d o s t e m n e ，s a l t i n d u c e sr e n a l i n n a m m a t i o na n df i b r o s i si nh y p e r t e n s i v

34、 er a t s I J K i d n e yI n t , 2 0 0 3 ，6 3 ( 4 ) ： 1 7 9 l 1 8 0 0 【8 】S h m a t aS N a g a s eM , Y n s h i d aS e ta 1 P o d e c y t e 鹅t h et a r g e tf o ra l d n s t e m n e ： m l e so fo x i d a t i v es t r e s sa n dS g kl J H y p e r t e n s i o n ，2 0 0 7 ，4 9 ( 9 ) ：3 5 5 - 3 6 4 【9 】余

35、碧影替米沙坦对高血压大鼠肾脏保护作用和足细胞P o d o e a l y x i n 表 达的影响f J l 武汉大学学报( 医学版) ，2 0 0 9 ，3 0 ( 5 ) ：5 8 8 5 8 9 【1 0 】周定S H R s 醛同酮水平肾脏纤维化与C D Z A P 的影响和依普利酮的 作用f D l 天津医科大学，2 0 0 9 【1 1 】粱伟不同降压药对醛固酮输注大鼠足细胞损伤的影响们中华肾脏 病杂志, 2 0 0 8 , 2 4 ( 1 2 ) ：9 0 3 - 9 0 4 ( 收稿日期：2 0 l O _ 0 6 _ 2 8 ) C H I N AM O D E R NM E D Ic I N E 中国当代医药1 1 万方数据